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(無題) 削除/引用 No.6359-8 - 2017/10/08 (日) 01:19:07 - X 無処理の骨髄血の塗抹標本、溶血処理後の有核細胞の塗抹標本、比重遠心後に溶血した低密度骨髄細胞の塗抹標本、を同一のサンプルから作成して比較してみる事をお勧めします。無処理の骨髄塗抹標本をコントロールとして、処理後のサンプルと比較して下さい。 溶血処理だけの場合、赤芽球の減少が見られると思いますが、他の細胞は残りますので、骨髄球系の細胞やリンパ球の比率は、相対的に上がるはずです。白血病の場合は、分化した骨髄球系の細胞やリンパ球は、もともと減少しているので、溶血しても増加がはっきりしないかもしれませんが、白血病芽球は見えるはずです。白血病の骨髄で、溶血処理後に芽球が見られなくなり、分化傾向にある（正常）骨髄球系細胞だけが残るのであれば、溶血処理に問題があるという事かと思います。溶血（ACK）バッファーの組成を再確認して作り直した方が良いかもしれません。 比重遠心＋溶血の場合、お使いのficollのdensityにもよりますが、単核球（白血病芽球、骨髄球系の未分化細胞、単球、リンパ球）が濃縮されます。赤血球系の細胞のほか、細胞比重が高い分化した好中球（band + seg）も除かれているはずです。分化した好中球が混じっているならば、ficollに何らかの問題があると考えられます。この場合は、比重遠心後、中間層の低密度細胞だけでなく、ペレットになった高密度細胞も回収し、溶血処理して塗抹標本を作り、芽球がペレットに落ちていないか確認する必要があると思います。なお、もし分化した好中球が混じっている場合は、CD45が少し弱めで、side scatterが高い細胞群としてFACSで検出されると思われますが、如何でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6359-7 - 2017/10/07 (土) 23:43:12 - もも 皆さま、沢山のご意見およびご指導本当にありがとうございます。 「ふむふむ」さん、「Kit」さん、「X」さんへ サンプルはヒトの骨髄血(白血病のときもある)です。すいません、Ficollは小分けされたものを使っているのためどこのメーカーか把握していません。確認しておきます。単核層はしっかりと見えています。回収後に遠心すると、沈渣が少し赤いので溶血しています。 手技に関して、他の方々にも確認してもらいましたが問題はなく、何故なくなってしまうのかわからないとのことです。また、FCMで測定する際には必ず標本を作製し、ライト染色にて細胞構成を確認していますが、やはりリンパ球、骨髄芽球が少なく、成熟段階にある骨髄系細胞が多いです。FCMでも類似した比率です。リンパ球はFSC-SSC、芽球はCD45 blast gatingで測定することが多いです。赤芽球は対象にしていません。 「ema」さんへ ありがとうございます。そちらの方法も試してみます。ミキサーは全く使わなくても大丈夫ですか？

(無題) 削除/引用 No.6359-6 - 2017/10/07 (土) 09:55:54 - X ヒトの骨髄血の解析なのか、マウスなど実験動物の骨髄なのか、よろしければ教えてもらえますか？芽球（ブラスト）と書かれているので、ヒトの骨髄血のような気がするのですが、一応確認です。 で、もしヒト骨髄だった場合、溶血法や比重遠心法で有核細胞を分離して、フローサイトメトリー（FCM）で芽球やリンパ系細胞の比率を測定しようとしているという事で良いですか？　サンプルは健常者の骨髄血（白血病患者さんからの、病的芽球が増加しているサンプルではなく）で、手法としてはCD45染色とside scatterを用いて芽球（CD45 blast gating）とリンパ球（CD45 bright/side scatter low）を測定していると理解して良いですか？ 健常者の骨髄の場合、骨髄芽球の比率はかなり低いですし、分化傾向にあるので白血病芽球の解析用のCD45 blast gatingではきちんと測定できないかもしれません。骨髄には、赤芽球という赤血球系の幼若細胞も存在しますが、溶血処理でダメージを受けるので、測定している「芽球」に赤芽球を含めるのであれば、比重遠心で得た低密度細胞を溶血処理なしでサンプルにしないと見れないと思います。 あと、芽球とリンパ球はside scatterが低い細胞群になりますので、フローサイトメトリーのthresholdの設定をside scatterで行なっている場合は、気をつけた方が良いかもしれません。極端に高いthreshold設定になっていると、acquisitionの段階で除外されてしまっているかもしれません。通常はforward scatterでthresholdは設定されていると思いますが、念のため。

(無題) 削除/引用 No.6359-5 - 2017/10/06 (金) 18:38:16 - Kit あっ、標本作製とあるからFACSは検定のためだけなのかな？そもそも、リンパ球・芽球判定もFACSではない？しかし、そうすると「FCM初心者です」という書き出しがわからなくなる・・・

(無題) 削除/引用 No.6359-4 - 2017/10/06 (金) 18:31:38 - Kit 「私がするとうまくいかない」=「ラボの他の人が同じ試薬を用いて同じ手順ですると問題ない」ということでしょうか？ リンパ球はFACSでT/B/NK細胞染色、あるいはFSC-SSCでのゲーティングで規定ですか？　芽球とはなんですか？Lineage marker-negativeの細胞集団ですか？リンパ球・芽球が1%を切るというと、残りは何なのですか？Myeloid細胞？ FicollはGE HealthcareのFicoll-Paqueですか？今回の問題の直接の原因ではないかもしれないけれど、ヒト血球用のFicoll(1.078 g/ml)はマウスでは軽すぎてリンパ球は取り損ないが出ますよ。マウス血球分離には低張にしてリンパ球を膨潤させ少しリンパ球の比重を本来より軽くするか、または等張1.083 g/mlの分離液を使う必要があります（AXIS-SHIELD OptiPrep Application Noteに解説があったように思います）。あと、Ficoll分離したら赤血球は分離されるため溶血操作はいらないのでは？（そもそもマウス骨髄細胞のFACSならばFicoll分離しなくても溶血操作いらない・・・）

(無題) 削除/引用 No.6359-3 - 2017/10/06 (金) 14:25:41 - ema 私は、溶血はたぶん一緒だとおもいますがACK Lusis Buffer:　NH4Cｌ　8.29ｇ・KHCO3　1ｇ・Na2EDTA　37.2ｍｇ/L（PH7.2-7.4）で行なっています。 後、遠心前にそれ以上の溶血をとめるため、当倍量以上のBuffer（培地や2％FCS　Hanksまたは0.1％BSA-PBS+(G)、ももさんのだと0.1%ALBPBSですね）を入れてます。B Cellに限らず、すべての場合でBuffer洗浄を行なっています。 また、ミキサーではなくPipettingで細胞懸濁液にします。（すこしマイルド） 死に易いようなら氷中で5分を2-3分と時間短くしても十分赤血球はのぞけます。

(無題) 削除/引用 No.6359-2 - 2017/10/06 (金) 13:57:44 - ふむふむ 普通に考えると、どちらの手法でもリンパ球、芽球が少なくなるのなら、溶結または比重遠心での分離過程以外のところに手技的な問題があるのでは？と思います。 比重遠心法で、ちゃんと単核層は見えるんですよね？ フローサイトメトリーの段階、あるいはその前の抗体染色の段階で手技的なミスがある気がしますので、その部分をちゃんとできてる人に確認してもらうことをおすすめします。 一度比重遠心法か、溶結法で分離した後に、ギムザ染色とかで白血球を染めて、リンパ球、芽球の比率を顕微鏡でカウントしてみては？ 何となくですが、そこのステップに問題があるとは思えないです。

リンパ球、芽球がなくなってしまいます。 削除/引用 No.6359-1 - 2017/10/03 (火) 07:45:48 - もも お世話になります。 FCM初心者です。 骨髄血から細胞を分離する方法として、全血溶血法や比重遠心分離法を用いているのですが、私がすると何故かリンパ球系、芽球が極端に少なくなってしまい(1%をきるときもあります)、とても困っています。ご指導の程、よろしくお願いいたします。 〈全血溶血法〉 骨髄血100μLに塩化アンモニウム4mL添加して溶血→混和後氷中で5分放置→1,500rpm,5min遠心→デカント後ミキサーでよく混和→0.1%ALBPBSで浮遊→標本作製 〈比重遠心分離法〉 骨髄血をPBSにて3倍希釈→Ficoll液にゆっくり重層、1,400rpm,20min遠心→単核層を回収→PBSを3mL程度加えて1,500rpm,5min遠心→デカント後ミキサーでよく混和→塩化アンモニウム溶液を4mL添加して溶血→遠心後、0.1%ALBPBSで浮遊→標本作製 ※B cellを測定するときは、上記の標本作製前の段階で0.1%ALBPBSで2回洗浄(1,500rpm,5min)しています。 ※0.1%ALBPBSで浮遊すると、白い凝集物(死細胞？)がよくできます。 長くてすいません。よろしくお願いいたします。

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