*修正して再投稿します。
リアルタイムPCRで、referenceとtargetのCt値の差が大きい場合、
皆様はどのように対処なさっているか教えてください。
私は現在referenceとして18Sを使用し、targetの発現を検討しています。
ご存知のように18Sの発現量は非常に多く、私の実験系だと6から10サイクルくらいから立ち上がり始め、Ct値は11から13くらいになります。
一方、targetの方は発現量が低く、Ct値は26から31くらいです。
一般的に、referenceとtargetのCt値に差がありすぎるのは良くないとされているのは知っていますが、
教員からは、「いろいろ試したけど18Sの変動が一番少ないから18Sを使えと言われています。
自分で実験していて思うのですが、18Sだと立ち上がりが早すぎて、ベースラインの設定もやりにくいし、そのような状態で定量性が担保できているのか心配です。
cDNAの希釈倍率を変えて、薄いものを18S、濃いものをtargetにするという方法が解決策の一つだと思うのですが、
これだと希釈の際の誤差が発生する危険性がありますよね。
リアルタイムPCRの系にアプライするcDNA量を変える（例えば18Sは1uL、targetは6uLとか・・・）のも有りかな、と考えているのですが、
この方法はよろしくないと教員が言っていて・・・。
私のラボは、リアルタイムPCRのいろいろな注意点をあまり重要視していないようで、
増幅効率を確認せずに比較Ct法をやったり、なかなか悩ましい状態です。
今回の私の疑問「referenceとtargetのCt値の開き」についてもスルーされてしまいまして、是非とも皆様のやり方をお伺いしたいと思っています。
よろしくお願いいたします。 |
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