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(無題) 削除/引用 No.6387-12 - 2017/10/16 (月) 09:51:12 - 774R 形質転換をやり直さなくても、出てきたコロニーや一晩培養菌を爪楊枝等でプレートにストリークすれば単一菌由来のコロニーは分離できますよ。

(無題) 削除/引用 No.6387-11 - 2017/10/16 (月) 07:20:59 - sci 中年さん、情報ありがとうございます。 長い方のトピックは、以前見たことがありました。極めて有益な情報で感銘を受けた記憶があります。感銘を受けた割にいまいち身についていなかったわけですが、やはり複数のプラスミドが保持されてしまうことは普通にあるということのようですね。 短い方のトピックは、まさに自分と全く同じ内容で笑いました。この時期にも日々このフォーラムは覗いていたので目にしていたはずですが、全く見覚えがありませんでした。意外と記憶は当てにならないものですね。質問する前に検索すべきだったかもしれません。 現状としては、コロニーPCRで非増幅コロニーが出現するまで、形質転換を繰り返そうかと思っています（非増幅コロニーが半分の割合ぐらいで出てきたら、それは間違いなく既に単一プラスミドのみのクローンが選択されていることになると思われるため）。 回答いただいた皆さまどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6387-10 - 2017/10/15 (日) 20:23:21 - 中年 類似のトピックが以前にもありました。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3040 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;start=7;Code=4996

(無題) 削除/引用 No.6387-9 - 2017/10/15 (日) 20:18:45 - 中年 複数のプラスミド（AとA'）が同時に形質転換されて、コロニーを形成する過程で個々の大腸菌細胞に関してはどちらかのプラスミドに収斂していくんだけど、コロニーとしてはAを持った細胞とA'を持った細胞が混在しているという状況だと思います。 お作法としては、その複数プラスミドが確認された形質転換体のコロニーから新しいプレートにシングルコロニーアイソレーションして、複数のシングルコロニーからプラスミドを調製して望むプラスミドを持つものを選ぶことになります。

(無題) 削除/引用 No.6387-8 - 2017/10/15 (日) 12:48:08 - sci おおさん、どうもありがとうございます。ab1ファイルの該当部前後3塩基ずつを画像でアップしたので、よろしければご覧になっていただければありがたいです（先ほどの投稿のリンク、見れますよね？） 重なったピークは、当然、親配列と目的産物の重なりになっています。 相補鎖というのは、逆向きのプライマーでシークエンスを読むということでしょうか。多分可能だと思うので、次回は逆鎖を読んでみようと思います。 とりあえずやはり再々度形質転換をするのが第一手のようですね。レアケースを2回連続で引いてしまっただけで、今ある他のコロニーは単一プラスミドなのかもしれませんが（…が、コロニーPCRで目的プラスミドが落ちたものが1つも見当たらないのは変なので、やはり直感ではまだ全てへテロな気がします）、ともかく安全を期して3度目の形質転換をしてみようかと思います。分かれてくれるといいのですが…。

(無題) 削除/引用 No.6387-7 - 2017/10/15 (日) 12:37:21 - おお その波形が示す塩基はMutation入れる前のえんきといっちするんですよねぇ。。。バックグランドがどれくらいかによって解釈が変わりそうですが、、、 相補鎖を読むことはできますか？

(無題) 削除/引用 No.6387-6 - 2017/10/15 (日) 12:29:12 - おお この場合のケースに当たるかどうかわかりませんが、一つの大腸菌に一つのプラスミドが入る程度のDNA量をトランスフェクションしないと、非常によく似たプラスミドが複数大腸菌に入ったとき（いつもやないけどおそらく稀に）複数の種類のプラスミドが共存したまま増えることもあるようです。 再度Transformationするときプラスミドの量を多くても１０ng（もっと少ないほうがいいでしょう）にすればそういう可能性がほぼ無くなるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.6387-5 - 2017/10/15 (日) 11:07:47 - sci 経験さん、経験談ありがとうございます。 再度形質転換からやり直した結果、なおもヘテロだったのですが、繰り返せば単離されるものなのでしょうかね…？ 現状手元のヘテロプラスミドをどうにかするのが一番ゴールに近いので、もう一度2回目のプラスミドを再形質転換してみようかと思います。これでもヘテロだったら…何かがおかしいとしか言えない感じでしょうか。とりあえずさらにプラスミドをぐっと減らして形質転換してみます。

(無題) 削除/引用 No.6387-4 - 2017/10/15 (日) 11:02:21 - sci 774Rさん、ありがとうございます。2回目のコロニーピックですが、ミニプレップ前にコロニーPCRを行っています。これは、Reverseプライマーの末端が変異3塩基に位置する形で、1回目のコロニーPCRから、親配列では全く増えないことが確認済みです。 その2回目のコロニーPCRですが、8コロニーしか試さなかったのですが、8つとも全て同じ強度のPCRバンドが得られたため、その内の1つをシークエンス解析へと進めました。そもそもこの時点で半々で増える増えないに分かれると思っていたので意外だったのですが、直感的には恐らく現状どのコロニーでも全て同じ状況ではないかと思います（読んでみないと分からないのはそうなのですが）。 一応、大した事ありませんがab1ファイルの該当部分の画像をアップロードしてみました。 dotup.org/uploda/dotup.org1363316.png ご提示いただいた考えられる可能性ですが、たまたま同じ位置にコロニーができた、という感じでしょうか…？2度もそんなことが起こるとは考え辛いですね…。 しかしそもそも疑問なのですが、用いているプラスミドはハイコピーとされるものなのですが、ハイコピーということは菌内で複数のプラスミドが維持されているということですよね。ということは、複数のプラスミドが入ってそのまま維持されることも十分ありそうな気がするのですが、導入効率と菌体濃度・プラスミド濃度の関係性とから、それは天文学的確率となるのでしょうか…？ しかしさらによく考えると、oriとマーカーの異なる複数のプラスミドを同時に形質転換させるということは普通になされており、問題なく2種類の抗生物質で選択される菌が出てくるようにも思うので、ありえない話ではないというか、むしろ1菌体にきっかり1分子のプラスミドのみが導入される方がおかしい話なのではないかという気もしてきました。 何か決定的に基本的な話を見落としているかもしれません。追ってアドバイスいただけると大変幸いに思います。

(無題) 削除/引用 No.6387-3 - 2017/10/15 (日) 10:57:46 - 経験 経験あります。 理由は忘れました。 解決方法は、再度、形質転換からやり直すことです。 4つほどコロニーを拾えば50%の確率で物が取れます。

(無題) 削除/引用 No.6387-2 - 2017/10/15 (日) 10:35:49 - 774R >コロニーピック時に複数クローンをつついてしまったのかもしれないと思い、そのプラスミドを用いて大腸菌を再度形質転換し、今度は確実にシングルコロニーをつつきました。 改めてその新しく得たプラスミドの配列を読んだところ、全く改善しておらず、完全に親配列と目的産物のピークが共存したままでした。 まず疑問に思ったのが、混合物と考えたプラスミドから目的のものを単利するために、普通に考えたら複数のコロニーをピックアップしてシーケンスを確認するべきだと思いますが、上記の文面からすると、一つしか確認してないように読み取れますが、その通りでしょうか？ シーケンス結果がヘテロになる原因についていろいろ考えてみましたが、どれも天文学的に可能性が低いものしか思いつかず、唯一ありえるかなと思ったのが次の可能性です。 大腸菌をプレーティングする前に遠心して一旦ペレットにして撒く場合、懸濁が不十分ですと複数の菌が混じったコロニーが出来る可能性があります。

複数プラスミドから1種類を単離したい 削除/引用 No.6387-1 - 2017/10/15 (日) 09:22:11 - sci Site-Directed Mutagenesis (SDM) で3塩基を置換したプラスミドの作製を試みています。 DpnI処理〜形質転換後、コロニーPCRでポジティブだったクローンからミニプレップをして得られたプラスミドのシークエンスを読んだところ、テンプレートの親配列と変異導入された目的産物の両方のピークがほぼ同じ大きさで共存していました。 コロニーピック時に複数クローンをつついてしまったのかもしれないと思い、そのプラスミドを用いて大腸菌を再度形質転換し、今度は確実にシングルコロニーをつつきました。 改めてその新しく得たプラスミドの配列を読んだところ、全く改善しておらず、完全に親配列と目的産物のピークが共存したままでした。 混合プラスミドの再形質転換後は本当にまばらにしかコロニーが生えていない状況のため、シングルコロニーアイソレーションは確実になされたと思うのですが、シングルコロニーであっても保持されているプラスミドがシングルとは限らないのでしょうか…？ SDMの効率が異常に悪く、コロニーPCRで30コロニー程度つついてようやく1つだけ当たりだったということもあり（それもおかしな話かもしれないのですが）、この得られた目的産物を混合状態からどうしても単離したいのですが、何かいい案はありませんでしょうか…？ アドバイスいただけたら大変幸いです。

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