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(無題) 削除/引用 No.6392-8 - 2017/10/18 (水) 08:59:13 - おお 濃縮したため血清のBSAなどが大過剰になり泳動がうまく行ってないのかも。 ポジコンとしては絶対に活性があると言えるものを使うのが望ましいです。そうするといろいろ問題を見つけやすいです。 SDSPAGEをして変性した状態から戻さないといけないのでSDSが完全に（邪魔しないように）抜けているかとか言うのもよく考えなければならない点かもしれません。 目で見て活性と思えるバンドが見当たらなければのぞみうすですが、バックライトを当てたりして見てますか？またそれで、フィルターで青をカットするとかなりコントラストがつくかなぁと無責任に思ってます。 また確かに染色が行き過ぎていて見にくい場合もありそうですね。脱色をもう少しすれば見えてくる可能性があるというのはうなずけます。 ゲルに載せないで大雑把に活性が見れるならやりやすいかもしれません。コラーゲンとまぜてその分解を見るとかできそうですし、、、（特異性までは言えませんけど）

(無題) 削除/引用 No.6392-7 - 2017/10/18 (水) 00:21:02 - しろ 染色が終わったゲルはお水につけて冷蔵庫で保存してみてください。染色が終わって白抜きバンドがうっすらしか見えなくて、失敗か？と思ってなんとなく取っておいたら2，3日後にバンドが見えてきたということが以前ありました。

(無題) 削除/引用 No.6392-6 - 2017/10/18 (水) 00:02:34 - レポータ実験 上清ではなく、ライセートをポジコンに用いたらいいと思います。 ちなみに感度は結構高いと思うので、うちは濃縮せず2日培養した培養上清を10マイクロLほどアプライしていますよ。きちんとワークしてます。感度はすごく高いはずです。

(無題) 削除/引用 No.6392-5 - 2017/10/17 (火) 23:57:52 - あo リコンビナントMMPのポジコンを設ける必要があると思います。それで検出できなければザイモグラフィー自体の問題、検出できればサンプル調製までの工程に何かしらの問題があると思います。また、データの信頼性という意味でもポジコンを設定する方が良いと思うので、そんなに高価な物ではないと思うので購入することをオススメします。

(無題) 削除/引用 No.6392-4 - 2017/10/17 (火) 15:09:59 - z 返信ありがとうございます あさん 一応、失活しないようにサンプルを回収したら、その日のうちに4℃の部屋で濃縮及びSDS-PAGEを行っています。 また、この前立腺癌細胞株の上清については、すでに論文でMMP活性が見られています。従って僕は自分のサンプルでも同様に活性が見られるものとして考えています。 TSさん MMPのリコンビナントのようなコラゲナーゼのリコンビナントは持っていないです。 他に何かポジコンとして使えるものがあれば、教えていただければ幸いです

(無題) 削除/引用 No.6392-3 - 2017/10/17 (火) 12:07:19 - TS トラブルシュートはどこに問題があるかを明らかにしていかないとうまくいきませんね。Abcamの指示通りにゲルや染色液を作っているのであれば、サンプルの問題かもしれません。失活化活性の低さとか。ポジコンはないですかね。昔、学生にやらせたとき、身近にあったコラゲナーゼで感度や検出限界などを調べさせましたが、確実にうまくいくはずのポジコンはないですか。

(無題) 削除/引用 No.6392-2 - 2017/10/17 (火) 11:24:27 - あ 研究したてのことですが， MMPに酵素活性がある前提での質問で大丈夫でしょうか？ 抽出からゲルへのアプライまでで失活していたら白抜きのバンドは見られません。

ゼラチンザイモグラフィーについて 削除/引用 No.6392-1 - 2017/10/16 (月) 20:24:05 - z まだ研究を初めたての初心者なのですが、Abcam社が掲載しているプロトコールを参考にゼラチンザイモグラフィーを行ったのですが、バンドがうまく見れません。 サンプルは前立腺癌細胞株の上清を使用しており、MMP2,MMP9の発現は確認できております。 試薬は全て、Abcam社が掲載している通りの組成です。SDS-PAGEは4℃で流しています。 ご教授よろしくお願いします。

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