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(無題) 削除/引用 No.6396-10 - 2017/11/02 (木) 21:50:11 - クロマト みなさま ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6396-9 - 2017/10/21 (土) 05:28:55 - stranger ゲル濾過を最初に行わない大きな理由は、ロードできる容量の制限から来てると思います。特に精製の初期段階では、夾雑物が多く含まれており、ゲル濾過で十分な分離を得られるような少量のサンプル量まで、濃縮しなくてはいけないからですし、時によっては溶解度が問題になるからです。 例えば、原材料が凍結乾燥されており、少量の展開液等で溶解できるならば、ゲル濾過を最初に持ってくるのは、悪い選択ではありません。分子量に差がある夾雑物が多く含まれている場合はあっという間に精製度が上がります。場合によっては、次のステップで、オープンカラムではなく、FPLCなどの高分離脳カラムが使えるケースもあります。 最初にイオン交換などを持ってくる理由は、通常は初期のサンプル量が多い割に目的物質の濃度が薄かったりすることが多いので、吸着、洗浄、溶出の過程で、精製と濃縮を兼ねて行うことができるからだと理解しています。もちろん、溶出のグラディエント次第で、サンプルの濃縮は達成しにくいことも多いですが。 スラリーの充填ですが、気泡が捕まらないように注意してつめますが、流し込んだ時に泡がトラップされてしまわないような濃度だったら問題ありませんが、充填が進むにつれてスラリーの濃度を下げて行きます。薄いスラリーの中に濃いスラリーが入ったりすると、撹拌が起きてしまい、美しい充填カラムになりません。あとスラリーの上には常に展開液があるようにするのは当然ですが気をつけてください。

(無題) 削除/引用 No.6396-8 - 2017/10/20 (金) 16:34:05 - おお >一発目からゲルろ過しているときがあって 原則さけますよね。結晶化のリコンビナントからの精製の解説で一発目にゲルろ過をやる選択肢もあるというようなのを見たことがあります。分子間でアグっていたりというのは他のカラムでは見分けがつかない（分離しにくいとか、分離できても区別ができないとか）などが理由のように思ってます。

(無題) 削除/引用 No.6396-7 - 2017/10/20 (金) 15:50:38 - マカロニ 1 高い濃度のスラリーを素早く流し込むことで、ノイズの原因になるカラム内での層形成を出来にくくする、と聞いたことがあります。 　薄いと何度も継ぎ足す必要があり、うっかりするとカラム下部に層が出来ることがありますので。 　ということであまり考えず、50〜80%スラリーくらいで注いでいます。多分説明書にも流し込むときの濃度について記載は無いか、少ないと思います。 2　これはアプリケーションとゲルの性質によります。自然落下とはいえゲル量が多いと、特に下層でゲルが詰まったようになり、そこがネックとなり結果として全体の流速が落ちることがあります。 　が、多分1 ml/min程度に調整すればだいたいどんなゲルでも終始安定して流せると思います。 3　多分層のことです。一度わざと層を作ってタンパク質を流したことがあります。その時は精製度にはさほど影響をうけませんでしたが、夾雑の色素が層あたりに色濃く残り続け、何となく気分が良いものではありませんでした。 4　現役です。 5　一発目ゲル濾過は確かにたまに見ますし、良くわからなくもありますが多分そのタンパクに対する経験的なものではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6396-6 - 2017/10/19 (木) 10:52:16 - クロマト 充填時のスラリー濃度は説明書読めって話になりますよね〜 当然の話ですよね。 成書に濃い濃度がいいみたいな記述があって，一般的にこんぐらいがいいっていうのがあるのかなと思って聞きました。 qqの資料もありがとうございました。 読んでおきます。 ゲルろ過よりもイオン交換を先に行うという話なんですけど， mozさんのおっしゃる通りだと思うですが， 論文とかよんでいると・・・，一発目からゲルろ過しているときがあって 選択肢としての理由がよくわからないのですが，どうなんでしょうか？ （硫安沈殿後なら，サンプル体積が減っている+脱塩したいってわかるんですが）

(無題) 削除/引用 No.6396-5 - 2017/10/18 (水) 16:42:33 - qq 使用する予定のゲル商品名を示さないと、答えられないことが多いと思います。 �@ゲル体積の1.5から2倍程度の液量で分散させると良いのではないか？ �A静水圧を限度内に保ちなさい。カラム（もしくはリザーバー）の上の液面から、カラムの下からチューブを伸ばしてポタポタ液が出る間の距離を一定にしなさいということ。 �B実験者によって，充填のうまい下手の大きく差が出るかもしれないね。 �CFPLCが使えるのであれば、そっちを使うかな。 もともとPharmaciaFCの"Gel filtration principles and methods"を強くお勧めします。webにころがっている。

(無題) 削除/引用 No.6396-3 - 2017/10/18 (水) 15:01:29 - moz 「初期段階のゲルろ過精製を目的」とありますが、 (1)どれくらいの液量を想定していますか？ (2)分子量で分画するのでしょうか。その場合、目的分子量はどれくらいでしょうか。 高分子を分けるものほど粒子の堅さが柔らかいので、使う樹脂によって�@�Aが変わりますので説明書を読んでください。 分子量で分画する場合、アプライする量は少ないほど分画が良くなりますし、長いカラムほど分画が良くなります。 それとも脱塩等のように低分子量物質を取り除くのでしょうか。 �B実験者によって，充填のうまい下手の大きく差が出るものなのか？ でます。でも脱塩カラムでは問題にならないことが多いです。充填が下手（ムラ・段差がある）だと分子量分画の再現性(近接する分子量のものと分離が悪くなる・出てくるフラクション＃が変わる等）が乏しくなります。リザーバーを使うと失敗が少ないです。 �C古いか新しいかというと古いです。ゲル濾過(分子量分画）っていうと通常1−数時間かかりますので、手動だと居眠りしますよ。。というか最初の精製にゲル濾過はお薦めしません。高価な樹脂を使っても汚れるだけで最悪使い捨てになります。脱塩処理でも試料の10倍以上の樹脂を使いますし。 初期の精製や扱う体積量が多い場合は、通常安価なイオン交換樹脂（DEAEセルロースなど）が選択肢となります。美味く条件設定できれば低分子物質も除けます。 具体的にはバッチ処理で目的物の体積を少なくしてから二次精製するのが定法です。陽イオン交換カラムが使えると最初のカラム処理で夾雑物がかなり減らせます。

オープンカラムの充填方法と実験方法 削除/引用 No.6396-1 - 2017/10/18 (水) 14:10:01 - クロマト オープンカラムに樹脂を充填と実験に関する質問です。 精製目的などがあると思いますが，とりあえず 初期段階のゲルろ過精製を目的とし，溶媒は静水圧（ポンプを使わず重力のみ）で流すという前提で質問させてください。 �@樹脂のスラリー濃度はどの程度がよいのか？ 　高濃度のものを一度につめた方がいいと聞きますが， 　具体的な濃度はどれほどでしょうか？ �A充填の際に，溶媒を流しながら詰めるときの流速の目安は 　どれくらいか？ �B実験者によって，充填のうまい下手の大きく差が出るものなのか？ �CFPLCやHPLCなどを利用した精製システムを使わず， 　静水圧で流したり，フラクションごとに手動で吸光度測定を行うような方法は 　揶揄されるほど古い方法であるのか？ 　初期の精製や扱える体積量が多い場合は，そんなに揶揄されるようなもの 　ではないと思いますがどうでしょうか？

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