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変異導入後、インサートのみ親プラスミドへ載せ替えはやる? トピック削除
No.6402-TOPIC - 2017/10/20 (金) 09:23:35 - Mutagenesis
お世話さまです。

一つお聞きしたいです。

プラスミド(8kb)に2塩基置換の変異導入を行いました。
シークエンスで確認後、実験に用いていますが、予想通り変異の有無で実験結果に差が生じました。

昔、iPCRを行なっていた時には先輩から、インサートのみ切り出して、元のプラスミドのバックボーンに載せ替えた方が安心だよ、と言われ、全くその通りだと思うので、そのように行なっていました。

今回、2塩基ということで、変異導入には16サイクル。Pfu Ultra IIを用いました。
インサートはせいぜい700bpほどですが、この場合でもやはりバックボーンを乗せ替えた方がいいのかな?と今更ながら思っていますが、みなさまはどうされていますでしょうか??
 
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(無題) 削除/引用
No.6402-13 - 2017/10/21 (土) 16:31:14 - AP
ベクターバックボーンの変異がどのくらい問題になりうるか、対策にコストをどれだけかける価値があるか。
費用対効果が合理的と考えるか非合理的と考えるかによって、ひとそれぞれの見解があるだろうし、その考え方を理解もできる。それを尊重せずに一概に間違いだというのは、先入観にとらわれ、深く考えもせず、教条主義になっているだけではないか。そういう硬直した考え方こそ、科学者・研究者の資質として問題があると思ってしまうがな。

バックボーンに変異が起こったときに問題になることはなんだろうか?
・プラスミドの増殖に支障をきたす→そういう変異体は増えないから拾ってしまう可能性は低い。変異があっても増えてくれればバックボーンの役目は果たしている。

・バックボーンの変異がたまたま導入遺伝子のパフォーマンスに影響を与えるかもしれない(発現調整的な?)→絶対ないとは言い切れないがかなり稀でしょっちゅう起こるとは考えにくい(そんな事例にあたったら、それで一本論文が書けてラッキーなくらい)。またもしそれを心配するなら、大腸菌で増やしたプラスミドにだって確率は違えど変異は起こるのだから、たまたま拾ったクローンがそういう変異を持っている可能性だってある。それを言い出したら乗せ変えたプラスミドだって全長シークエンスすべきだよな。もとのベクターに乗せかえることで意図せぬ変異がはいる確率は減るかもしれないが、絶対ないとは言い切れないもんな。

所詮は程度の問題。その確率を無視できる程度、問題になることはまずないと考えるか、わずかでも可能性があるなら徹底的にチェックすると考えるか(コスト度外視で)、ちょっとでも確率を下げられて手間や費用がそれほどでもなければ対策したほうが安心と考えるか、どれが正解ということもなかろう。

(無題) 削除/引用
No.6402-12 - 2017/10/21 (土) 02:56:34 - おお
エラーがない保証という点では大腸菌で増やしても程度のさこそあれ保証がないともいえるし、

(無題) 削除/引用
No.6402-11 - 2017/10/21 (土) 02:53:21 - おお
もし載せ替えないなら、作製したときにできた複数のクローンで実験結果に差がないことを確認しておく手があるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.6402-10 - 2017/10/20 (金) 22:06:33 - 774R
載せ替えるって言ってるのに、畳み掛けるように研究者としての資質まで問題視するとか、きっと気分がいいんだろうな…

(無題) 削除/引用
No.6402-9 - 2017/10/20 (金) 21:50:25 - AP
いや、そこまでいうほどでもなかろう。

(無題) 削除/引用
No.6402-8 - 2017/10/20 (金) 19:39:17 - be
言うまでもなく、載せ替えすべきです。
シークエンスで全長読んでPCRエラーが起こってないか確認しているのならまだしも、それを怠り目的の配列だけ確認するのは研究者としてどうかと思いますよ。全長数kb(4-6kbくらい?)が全くエラーなく増幅されている根拠がないでしょう?

(無題) 削除/引用
No.6402-7 - 2017/10/20 (金) 12:20:06 - おお
レポータープラスミドならちょっと心配ですね。。。全部シーケンスしてしまうという手もあるかも。

(無題) 削除/引用
No.6402-6 - 2017/10/20 (金) 10:08:55 - トピ主
心配性さん、

ありがとうございます。はい、そのようにします。

(無題) 削除/引用
No.6402-5 - 2017/10/20 (金) 10:07:25 - 心配性
私も心配性なので載せ換えます。

今まで、トータル100種類以上のベクターを作成してきました。それら全てで必ずシークエンス読んできました。PCRに由来する変異は一回も経験したことありません(あ、一塩基変わってる!と思って作り直したり調べ直ししたことは何度かありますが、結局SNPだったことばかり)。それでも、万が一があったら、しかもその万が一がクリティカルなところでやってきたら困るから、必ずシークエンス読みます。載せ換えも必ずやります。

(無題) 削除/引用
No.6402-4 - 2017/10/20 (金) 09:58:15 - Mutagenesis
おおさま、中年さま、ありがとうございます。

レポータープラスミドなのですよね。刺激によりGFPが発現するようなプラスミドです。
やはり実験の性質上、心配ですよね。。一度載せ替えを検討してみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.6402-3 - 2017/10/20 (金) 09:55:39 - 中年
私は心配性なので載せ換えます。

(無題) 削除/引用
No.6402-2 - 2017/10/20 (金) 09:50:58 - おお
インサート以外の配列は発現ベクターとして機能しているかが重要なところで、発現していればそれで基本的にはいいかと思います。

変異導入後、インサートのみ親プラスミドへ載せ替えはやる? 削除/引用
No.6402-1 - 2017/10/20 (金) 09:23:35 - Mutagenesis
お世話さまです。

一つお聞きしたいです。

プラスミド(8kb)に2塩基置換の変異導入を行いました。
シークエンスで確認後、実験に用いていますが、予想通り変異の有無で実験結果に差が生じました。

昔、iPCRを行なっていた時には先輩から、インサートのみ切り出して、元のプラスミドのバックボーンに載せ替えた方が安心だよ、と言われ、全くその通りだと思うので、そのように行なっていました。

今回、2塩基ということで、変異導入には16サイクル。Pfu Ultra IIを用いました。
インサートはせいぜい700bpほどですが、この場合でもやはりバックボーンを乗せ替えた方がいいのかな?と今更ながら思っていますが、みなさまはどうされていますでしょうか??

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