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ELISAによるマウスIgE検出について トピック削除
No.6403-TOPIC - 2017/10/20 (金) 17:08:29 - 免疫勉強中

初歩的な質問を失礼致します。

マウス血清中のハプテン特異的IgEの検出を試みております。

以下の条件にてELISAを行っていますが、
特異的でないと考えられる反応が出てしまい検出されません。

(具体的に言うと、血清希釈に使用したvehicle添加ウェルが0.3程度のOD405、
血清を添加したwellではすべてのウェルで2.0程度のOD405です)


Rat Anti-Mouse IgE-UNLB (Isotype：Rat IgG1κ) 5μl/mlを4℃over nightで吸着
↓
blocking reagentでブロッキング3hr
↓
10倍希釈したマウス血清サンプルを添加1hr
↓
アルブミンに結合させたハプテンを添加1hr
↓
polyclonalの抗ハプテン抗体(HRP conjugate,Host/Isotype：Rabbit/IgG) 1μl/mlを添加1hr
↓
ABTS添加、20minでOD405測定


また、血清サンプル添加後にGoat Anti-Mouse IgE,HRP conjugateを添加して検出するとすべてのウェルで反応が見られなくなります。


予想では、プレートに吸着させた抗体と血清中のIgGが反応してしまっていると考えています。
吸着させる抗体を変えることも検討せねばならないと考えておりますが、選ぶ際の基準などもお教えいただけたら幸いです。


なお、ハプテン特異的なIgGは同じサンプルおよび同じハプテン結合アルブミンを用いたELISAで検出できております。


ポジティブコントロールをとっていないためこの実験系が走るかどうかも確定できていない状態で大変恐縮ではございますが。(当方経験も浅く、また下っ端のためポジコン用の試薬を購入してもらうことができません…)
ご指導ご鞭撻の程よろしくお願い致します。
　
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ELISAによるマウスIgE検出について 削除/引用
No.6403-3 - 2017/10/23 (月) 11:16:01 - 免疫勉強中

あ様

ご回答誠にありがとうございます。


> サンドイッチ法でなく間接法ではダメでしょうか.
> ハプテン-アルブミンで固相化
> ↓
> マウス血清
> ↓
> HRP-conjugated anti-mouse IgE antibodyみたいな感じで.

こちらの方法でも検出を試みましたが、
おそらく10倍という濃度ですとIgGが先に反応してしまい、
まったく検出されないという結果になりました。

> あと吸光度が頭打ちしてそうなので, 血清の希釈倍率を50倍とか100倍にした方が良いかもしれません.

こちらも検討済です。(記載が抜けていて申し訳ございません)
希釈倍率を上げていくと吸光度が等しく下がっていくため、
やはり血清中のIgGあるいは他のタンパク質の影響かと考えております。

(無題) 削除/引用
No.6403-2 - 2017/10/20 (金) 21:48:02 - あ
> 吸着させる抗体を変えることも検討せねばならないと考えておりますが、選ぶ際の基準などもお教えいただけたら幸いです。

サンドイッチ法でなく間接法ではダメでしょうか.
ハプテン-アルブミンで固相化
↓
マウス血清
↓
HRP-conjugated anti-mouse IgE antibodyみたいな感じで.

あと吸光度が頭打ちしてそうなので, 血清の希釈倍率を50倍とか100倍にした方が良いかもしれません.

> なお、ハプテン特異的なIgGは同じサンプルおよび同じハプテン結合アルブミンを用いたELISAで検出できております。
> ポジティブコントロールをとっていないためこの実験系が走るかどうかも確定できていない状態で大変恐縮ではございますが。

ハプテン特異的IgGを検出したときのポジコンはどのように設定したのでしょうか.
それと同じことをIgEでもすれば良いのかなと思いました.

ELISAによるマウスIgE検出について 削除/引用
No.6403-1 - 2017/10/20 (金) 17:08:29 - 免疫勉強中

初歩的な質問を失礼致します。

マウス血清中のハプテン特異的IgEの検出を試みております。

以下の条件にてELISAを行っていますが、
特異的でないと考えられる反応が出てしまい検出されません。

(具体的に言うと、血清希釈に使用したvehicle添加ウェルが0.3程度のOD405、
血清を添加したwellではすべてのウェルで2.0程度のOD405です)


Rat Anti-Mouse IgE-UNLB (Isotype：Rat IgG1κ) 5μl/mlを4℃over nightで吸着
↓
blocking reagentでブロッキング3hr
↓
10倍希釈したマウス血清サンプルを添加1hr
↓
アルブミンに結合させたハプテンを添加1hr
↓
polyclonalの抗ハプテン抗体(HRP conjugate,Host/Isotype：Rabbit/IgG) 1μl/mlを添加1hr
↓
ABTS添加、20minでOD405測定


また、血清サンプル添加後にGoat Anti-Mouse IgE,HRP conjugateを添加して検出するとすべてのウェルで反応が見られなくなります。


予想では、プレートに吸着させた抗体と血清中のIgGが反応してしまっていると考えています。
吸着させる抗体を変えることも検討せねばならないと考えておりますが、選ぶ際の基準などもお教えいただけたら幸いです。


なお、ハプテン特異的なIgGは同じサンプルおよび同じハプテン結合アルブミンを用いたELISAで検出できております。


ポジティブコントロールをとっていないためこの実験系が走るかどうかも確定できていない状態で大変恐縮ではございますが。(当方経験も浅く、また下っ端のためポジコン用の試薬を購入してもらうことができません…)
ご指導ご鞭撻の程よろしくお願い致します。
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