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赤くなった酵母のコロニー トピック削除
No.6437-TOPIC - 2017/11/04 (土) 13:53:33 - Red
質問が複数あって申し訳ないのですが、順に列挙させていただこうと思います。

1. 酵母を培養しすぎるとAdeの枯渇によりコロニーが赤くなると思うのですが、これはade2に変異がない酵母でも、あまりにもAdeが枯渇した場合は赤くなるものなのでしょうか…?Genotype的にはade2に変異がないはずの株で赤くなったのですが、ひょっとして株が間違っていたのかもしれないと気になりました。

2. 経験上、一度赤くなったクローンは、他と比べて異様に早く赤くなる気がします。つまり、例えば赤くなった培養液から作ったグリセロールストックを起こした場合、培養の初期から既に全コロニーが赤い、また同様に逆の話で赤いコロニーをつついて液体培養した場合、培養液はそんなに長時間培養しなくてもすぐに赤くなる、といった具合です。
これは思い込みによる勘違いではなく、そういうものなのでしょうか?特に前者は、同じプレート中で他の株は白いままなのに特定の株だけ赤いことがあるので、培地中のAdeが枯渇した訳ではないと思うのですが…。

3. そしてこの赤くなる運命が決定してしまったような株を使うことに、特に問題はないのでしょうか?例えば赤くなることで生育速度に有意に違いが出たり、特定のタンパク発現レベルが変わってしまっているなど、下流の実験で問題がある場合はあるのでしょうか?

4. 2と3にも関連しているのですが、赤い培養液からのGenomic DNAやトータルタンパク質を取ってきた場合、いつまで経ってもサンプルが赤いままである気がします。
実験によるとしか言えないとは思いますが、この赤い色素のコンタミは問題ないのか、なぜそんなにしつこいのか、また赤色をどうしても除きたいならどうすればよいのか(フェノクロ・エタ沈でも赤いままな気がしまするので、脂溶性でも水溶性でもない…?難溶性…?)、TIPSがありましたら紹介いただけるとありがたいです。


長々とすみません。よろしくお願い致します。
 
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(無題) 削除/引用
No.6437-2 - 2017/11/07 (火) 11:40:08 - 弘法
1.ade2かade1の変異株以外で赤いコロニーが生じた経験は私にはありません。赤い色素はアデニン代謝の中間産物であるP-ribosylamino imidazole(AIR)が蓄積して重合したものですので、そういう状況が生じればこれらの変異株以外でも赤くなることはあり得なくはないのかなと思いますが。お使いの株のgenotypeと培養条件はどのようになっていますか?

2.これも私自身は意識したことがありませんでしたが、色素がAIRのヘテロな重合物であることから考えると、重合の核となるような色素があると重合反応が進みやすいというようかことはあるかもしれません。

3.この色素が微小管の重合を邪魔すると聞いたことがあります。生合成経路のさらに上流に変異を生じて白いコロニーを作るようになった株は、赤い親株より元気なコロニーを作ることはよく経験します。それ以前に、アデニンの生合成に不具合があるわけですから、そちらの理由からも生育には影響があるでしょうね。

4.高分子なのでエタノール沈殿されます。また、ヘテロな重合物なのできれいに分画するのは難しいと思います。DNAならば精製用のカラムなどで除けるかもしれません。還元剤を入れてインキュベートすると脱重合したりするかもしれません(しないかもしれません)。

ご覧になっているのが本当にAIRの重合物である赤い色素なのかどうかで対応は全く違ってくると思います。もし、本当にAIR重合物であるならば、培地に十分量(もしくは過剰量)のアデニンを加えておけば、アデニン生合成経路は発現のレベルでも活性のレベルでも抑制されるでしょうから、色素の蓄積は起こらなくなるはずだと思います。

赤くなった酵母のコロニー 削除/引用
No.6437-1 - 2017/11/04 (土) 13:53:33 - Red
質問が複数あって申し訳ないのですが、順に列挙させていただこうと思います。

1. 酵母を培養しすぎるとAdeの枯渇によりコロニーが赤くなると思うのですが、これはade2に変異がない酵母でも、あまりにもAdeが枯渇した場合は赤くなるものなのでしょうか…?Genotype的にはade2に変異がないはずの株で赤くなったのですが、ひょっとして株が間違っていたのかもしれないと気になりました。

2. 経験上、一度赤くなったクローンは、他と比べて異様に早く赤くなる気がします。つまり、例えば赤くなった培養液から作ったグリセロールストックを起こした場合、培養の初期から既に全コロニーが赤い、また同様に逆の話で赤いコロニーをつついて液体培養した場合、培養液はそんなに長時間培養しなくてもすぐに赤くなる、といった具合です。
これは思い込みによる勘違いではなく、そういうものなのでしょうか?特に前者は、同じプレート中で他の株は白いままなのに特定の株だけ赤いことがあるので、培地中のAdeが枯渇した訳ではないと思うのですが…。

3. そしてこの赤くなる運命が決定してしまったような株を使うことに、特に問題はないのでしょうか?例えば赤くなることで生育速度に有意に違いが出たり、特定のタンパク発現レベルが変わってしまっているなど、下流の実験で問題がある場合はあるのでしょうか?

4. 2と3にも関連しているのですが、赤い培養液からのGenomic DNAやトータルタンパク質を取ってきた場合、いつまで経ってもサンプルが赤いままである気がします。
実験によるとしか言えないとは思いますが、この赤い色素のコンタミは問題ないのか、なぜそんなにしつこいのか、また赤色をどうしても除きたいならどうすればよいのか(フェノクロ・エタ沈でも赤いままな気がしまするので、脂溶性でも水溶性でもない…?難溶性…?)、TIPSがありましたら紹介いただけるとありがたいです。


長々とすみません。よろしくお願い致します。

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