いつも勉強させて頂いております。
SDS-PAGEのトラブルシューティングでご意見頂ければと思い書き込みを致しました。
HEK293T細胞にCAG promoterを持つベクターで目的タンパクを共発現させてウエスタンブロットやIPをしています。最近2×SDS sample bufferを作りかえたところ、サンプルを流したレーンが低分子になるにつれて狭くなるといった現象が起きて困っています。今までは問題なかったことから2×SDS sample bufferが原因と考えてはいますが、具体的に何が問題なのかわかりません。
@HEK293T 10pディッシュにリン酸カルシウム法でベクターを合計20μgトランスフェクション
Ahypotonic buffer 500μL(20mM HEPES pH7.4, 1.5mM MgCl2, 10mM KCl, 1mM EDTA, TritonX 0.1-0.5%)で細胞を懸濁し、27G針で20回程度通した後に15分 on iceで静置（protease inhibitor cocktail添加済み）。
B800Gで5分間遠心し、上清をさらに20000Gで60分間遠心。
C上清を細胞溶解液として2×SDS sample buffer（100mM Tris-HCl pH6.8, 4% SDS, 12% 2ME, 20% glycerol）と等量ずつ混合して95℃ 3分間ボイル
D自作の15％アクリルアミドゲル（使用したAPS、TEMEDは新品）にサンプル10μLをアプライして20mA通電で電気泳動。分子量マーカーはBioRadのprecision plus Kaleidoscopeを5倍希釈して使用しています。
上記の手順で行っていますがサンプルを流したレーンがY字のようになって、低分子の部分で狭くなってしまっています（かわりにマーカーのレーンが低分子の部分で広くなります）。
細胞なしの状態でlysis bufferと2×SDS sample bufferを等量混合して電気泳動したときにはレーンは正常だったので、細胞から持ち込んだ塩が影響しているのかと考えて、2×SDS sample bufferをTris-HClの濃度を60mM〜140mMまでふってみましたが、あまり変化はありませんでした。
塩濃度以外に何か原因として考えられるものはありますでしょうか？
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