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どうもありがとうございました 削除/引用 No.6454-8 - 2017/11/20 (月) 11:00:15 - bbb 皆様ご丁寧に返信ありがとうございました。 実際にイオン交換クロマトグラフィーを行ってばっちり理解できました。 自分自身はHis-tag付きのタンパク質をアフィニティクロマトグラフィーで精製することしかやったことがなかったので、ある特定のNaCl濃度で目的タンパクのみがでてくるものだと勘違いしていました。案の定SDS-PAGEで確認してみると他のタンパクもフラクションに確認できました。ここから疎水性、ゲルろ過などで精製を続けていくみたいです。 あほな質問どうもすいませんでした。。。

(無題) 削除/引用 No.6454-7 - 2017/11/17 (金) 14:29:20 - cDNA 予想としては、アフィニティークロマトフィー(特にバッチ法)の経験があって、それと混同しているのではないかと思います。 イオン交換では塩濃度のグラジエントを掛けながらクロマトグラムを描く。目的タンパク質がどこに出るかはそのタンパク質次第ですね。活性で見えるのか、抗体等でしか判断できないのか。 実験書のたぐいを見ればすぐに理解できるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6454-6 - 2017/11/15 (水) 22:20:58 - くぁwせdrftgy 蛋白質ごとに極性アミノ酸の組成は異なるので、個々の蛋白質全体の（分子表面の）プラスあるいはマイナスの電荷もそれぞれで異なります。非常に弱くチャージしているものから強くチャージしているものまであります。いずれもイオン交換樹脂に結合したとしても, そのあと流すbufferの塩濃度を上げて行くと前者の方が低塩濃度ですみやかに、また後者は高い塩濃度になるにつれてようやく離脱します。よって溶出は塩濃度を段階的に（ステップワイズ溶出）あるいは時間とともに徐々に上げていくプログラムで行われ（濃度勾配溶出）ます。塩濃度が増加するにともない溶け出してきた画分を順次、経過的に回収します。個々の蛋白質でカラムから離脱するのに要する塩濃度がことなるので、結果としてそれぞれは異なる画分に溶出してきます。もちろん荷電状態が似たような蛋白質はたくさんあるので、実際には一つの画分には複数の（多数の）種類の蛋白質が含まれています。とくに精製初期の純度の低いサンプルでは顕著です。ゆえに組織や細胞の抽出物からイオン交換カラムの１段階の精製だけで目指す蛋白質がほぼ単一まで精製されることは現実にはほとんどありません。通常は分離原理のことなる複数のクロマトグラフィーを組み合わせる事で段階的に精製をすすめていきます。

(無題) 削除/引用 No.6454-5 - 2017/11/15 (水) 18:01:12 - mon ＞サンプル中には他のタンパク質も含まれているため目的タンパクと同じ側のチャージを持つタンパク質はすべて担体と結合してしまうような気がします。 「結合するか否かは、pH（タンパクの電荷が変わる）および塩濃度（対イオン濃度）に影響される」ことはわかるよね？（pIの質問があるのでわかっていると思いますが、念のため）。 なお、機器によってpHスカウティングが可能なものがあり（自動でｐHを変えながら溶出パターンを比較できる）目的タンパクの分離に最適なｐHを選ぶことができます。 手動でもバッチ法で目的タンパクがカラムに結合するpH条件を探せます。

(無題) 削除/引用 No.6454-2 - 2017/11/15 (水) 13:05:02 - おお サンプル中の目的タンパクだけ精製できるわけではありません。違う蛋白があなたの目的の蛋白のピークに重なっていることはよくあることだと思います。 pIは計算してくれるソフトがあります。WEBベースのものもあるので検索してみたらいいかと思います。ただしそれは理論上で、修飾されていれば違ってくるし、立体構造的に内側にある残基はイオン交換体との相互作用に寄与しませんし、目安でしかありません。私はそのような理由でイオン交換ではpIをほぼ無視しています。 理論的pIじゃなくって実測値ならば等電点電気泳動で流して決める手はあります。

イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質の精製 削除/引用 No.6454-1 - 2017/11/15 (水) 12:55:57 - bbb お世話になっております おそらくかなり初歩的な質問だとは思うんですが、タンパク質のイオン交換クロマトグラフィーについてわからないことがあります。 イオン交換クロマトグラフィーの原理はわかるのですがそれでサンプル中の目的タンパクだけが精製できる原理がわかりません。サンプル中には他のタンパク質も含まれているため目的タンパクと同じ側のチャージを持つタンパク質はすべて担体と結合してしまうような気がします。また目的タンパクの等電点などはどのようにしてわかるのでしょうか。

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