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1step real-time PCRはkitがなければ出来ないのか。 トピック削除
No.6469-TOPIC - 2017/11/20 (月) 16:42:19 - くしゅん
近々real-time PCRに挑戦する予定の学部生です。real-time PCRは1stepと2stepの二通りのやり方があるようですが、1stepを行いたい場合、2stepの後半で使う試薬と始めの段階で使う試薬を1つのチューブに混ぜてreactionさせてはいけないのでしょうか?1step用の試薬kitが必ず必要なのでしょうか。total RNA量が1~10ug/mlと少ないため、one stepも検討してみたく、質問しました。
宜しければ、ご教示お願いします。
 
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.6469-5 - 2017/11/22 (水) 11:34:12 - くしゅん
>[Re:4] おおさんは書きました :
> https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2291734/
参考文献をありがとうございます。

>[Re:2] monさんは書きました :
> 濃度表示で「少ない」という表記は意味不明です。
そうですね。少ないもので40ngと書きたかったのですが、うっかりしておりました。
再度エタ沈して濃縮しようと思います。

お二方、早々にご教授いただき、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.6469-4 - 2017/11/22 (水) 01:11:19 - おお
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2291734/

(無題) 削除/引用
No.6469-3 - 2017/11/21 (火) 18:54:23 - mon
まあ、貴重でないRNAで比較するのが早いかも。試行錯誤は大切。

(無題) 削除/引用
No.6469-2 - 2017/11/21 (火) 11:08:14 - mon
>total RNA量が1~10ug/mlと少ないため、one stepも検討してみたく
濃度表示で「少ない」という表記は意味不明です。薄いなら濃縮すれば良いだけです。
基本的に2-Stepの方が増幅効率は良いですが、手技が増えテクニカルエラーが増える事を懸念しているとして。。。

基本的な考えとして、原理がわからないならマニュアルに従うのが基本です。
また、使用する方が多い>商売になる>Kitの開発となるので、kit開発の元になった論文を探せば方法は見つかります。RT-PCRくらいメジャーな技術ならManual本もあるでしょう。あるいはkit(使用酵素)のManualをみれば参考文献が記載されているでしょう。

2-step RT-PCRでは逆転写とPCR増幅を分けて別々の酵素を使う事が多く、それぞれの至適条件が異なる可能性があります。逆転写では汎用Primerを使用しているかも。

kitによっては混ぜても大丈夫なものもあるでしょうが、詳細がわからないと判断できません。RT-PCR kitのように複数社で販売されるいるくらいになると、差別化のためそれぞれで至適化されていると思います。そのため2 Step用の試薬を混合するするのはお薦めできません。ただし1 Stepでも使用できると記載されているkitもあったと思います。

1step real-time PCRはkitがなければ出来ないのか。 削除/引用
No.6469-1 - 2017/11/20 (月) 16:42:19 - くしゅん
近々real-time PCRに挑戦する予定の学部生です。real-time PCRは1stepと2stepの二通りのやり方があるようですが、1stepを行いたい場合、2stepの後半で使う試薬と始めの段階で使う試薬を1つのチューブに混ぜてreactionさせてはいけないのでしょうか?1step用の試薬kitが必ず必要なのでしょうか。total RNA量が1~10ug/mlと少ないため、one stepも検討してみたく、質問しました。
宜しければ、ご教示お願いします。

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