BioTechnicalフォーラム [RNA精製と逆転写反応のキット]

RNA精製と逆転写反応のキット

No.6478-TOPIC - 2017/11/23 (木) 19:01:47 - オルガ

こんばんは。いつも参考にさせてもらっています。

total RNA精製と逆転写反応のキットについて、おすすめの製品を教えてもらえないでしょうか。マウス組織について、定量リアルタイムPCRをする予定です。

これまでは、QIAGEN製品を使っていましたが、研究費の大幅な削減があり、予算的に厳しくなりました。試しに磁気ビーズ法の製品を使ってみましたが、ビーズが凝集（？）することが何度かあり回収率が低かったため、メンブレン精製でのキットを探しています。タカラバイオやニッポンジーンの製品が興味があるのですが、実際に使っている人の意見をききたくて投稿しました。

どうぞご意見よろしくお願いします。
　

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ありがとうございます

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No.6478-9 - 2017/12/21 (木) 10:09:23 - オルガ

＞ふみ様
しばらく確認しておらず、気づくのが遅くなり、申訳ありません。
情報頂き、ありがとうございました。
予算が限られている中、何を優先するか、もう一度考えてみたいと思います。

シリカメンブレンカラム

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No.6478-8 - 2017/11/27 (月) 23:12:43 - ふみ

改良されているかもしれないというコメントがありました。
その通りで、カラムに通す前のエタノール終濃度を高くすることで、small RNAが取れるようになっています。QiagenやMacherey-Nagel製のものが定評があって手に入りやすいかと思います。高くつくという問題はあるにしても誰がどうやっても同じように安定して綺麗に取れるという安心感はあります。ご参考まで。

ありがとうございました。

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No.6478-7 - 2017/11/27 (月) 17:59:27 - オルガ

返信が遅くなり、申訳ありません。

＞おおさま
直にお返事頂き、ありがとうございました。
勉強不足で、小さなRNAについては考慮していませんでしたが、
調べてみると抽出効率が良いことを謳っている試薬（ISOGEN II等）もありました。
たしかにフェノール製剤が使用されていたのですが、
今後の分析のことも考えて、必要かどうか検討しようと思います。

＞APさま
貴重な情報を頂き、ありがとうございました。
具体例をあげ、特徴を説明して下さり、とても参考になりました。
丁度キャンペーン中の商品もあったので、購入したいと思います。

初心者に丁寧なご意見を頂けて、とてもありがたかったです。
情報頂きまして、感謝いたします。

(無題)

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No.6478-6 - 2017/11/24 (金) 14:25:01 - おお

キットは小さなRNAが注目を浴びるようになってから敬遠しています。シリカベーすの従来のTotalRNA用のものは回収できないので。最近は改良されているのかもしれませんけど。

なのでTrizolで精製して、小さなRNAも回収しておけばあとで必要なときに解析ができますしRNAsol（だったかな）だとサイズによって分けて回収できるようになっているようです。ただしこのような試薬は（おそらく両方共）フェノールが入っているのでラボによっては使いにくいかもしれません。

(無題)

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No.6478-5 - 2017/11/24 (金) 13:49:33 - AP

カラム式のキットはインプット量に関係なく1サンプル1カラム一回分の試薬を使うことになるので、融通が効かず経済的ではないかもしれない。

AGPC法のmonophasic reagent、その進化版であるRNAzol、Isogen II（どちらも同じレシピの商品名）はいかがだろうか。従来のクロロフォルムを加えて相分離させて水層をとるのではなく、沈殿と上清に分かれ上清を回収する。中間層や有機層を吸わないように水層をとる厄介なことがなく、かつ沈殿となるDNAの除去能もいいようだ。

qPCRの逆転写は最近はToyoboのReverTra Ace qPCR RT Master Mixをよく使っている。一液式のプレミックスなので楽。定価ベース、フルスケール反応で1反応200円くらい。実際はキャンペーンや納入値引きがあるし、スケールダウンもある程度できるので100円以下になると思う。他製品とじっくりコスト比較をしたことはないけれど。

Superscriptシリーズは改良されるごとに熱耐性が高まり、高温反応で二次構造障害を回避できるってんで贔屓にしていたんだが、最近、RNAを金属イオン存在下で加熱するのはRNAの分解を引き起こすというのが常識となって、反応温度を高めることに魅力を感じなくなった。近頃じゃ並の反応温度でも伸長性能がいいが出てきてるみたいだし。

(無題)

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No.6478-4 - 2017/11/24 (金) 05:45:25 - おお

RTはLifeTechnologyのSuperScript IIIでキットと言うより酵素とそれについてくるバッファーを使っている。OligodTやランダムプライマーはオリゴをプライマーなどを合成しているところに頼んだものが山ほどあるので一生買う必要がないかもしれない。

(無題)

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No.6478-3 - 2017/11/24 (金) 03:57:16 - おお

アジレント（stratageneだっけ）も出してたと思うが、それぞれサンプル請求してサンプルが手に入ったところから良さげなのを選ぶのも手かもしれない。

(無題)

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No.6478-2 - 2017/11/24 (金) 03:53:26 - おお

GEやプロメガは使ったことがあります。プロメガは結構昔で商品はその時よりかなり改変されているかもしれません。