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フィルターによる大腸菌ライセートの清澄化 トピック削除
No.6508-TOPIC - 2017/12/05 (火) 15:17:53 - ATG
プラスミドを精製する時に大腸菌ライセートを遠心にて不溶物の分離しているのですが、高速遠心機がないため3,000 rpmで回しており、不完全な分離になってしまっています。できればQIA filterみたいに濾過法で清澄化できたらと思うのですが、QIA filter相当品を単体で入手することはできないでしょうか?あるいは自作する方法とか、何かアイデアがありましたよろしくお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.6508-8 - 2017/12/07 (木) 23:02:47 - ATG
早速やってみました。
自身では液体をあまり吸わないフィルター素材として、グラスウールとセラミックファイバーを選びました。理化学カタログでは適当なものが見つけられませんでしたので、断熱材用と思われるもの(モノタロウから購入)を、オートクレーブして用いることにしました。グラスウールは糸状のもので目が粗く、対しセラミックファイバーはコットンみたいで目が細かいものです。
それぞれ25 mlシリングの底に薄く敷き、100 ml培養からの大腸菌ライセートを入れました。どちらも自然落下でスルスルとほとんどが落ちてきましたが、念のためプランジャーでの押し出し操作をしました。グラスウールのカラムではぎゅっと下まで押し込めたのに対し、セラミックファイバーでは詰まってプランジャーは途中で止まってしまいました。ただ、プランジャー押し込みはなくてもたいしたロスはなかったとは思います。
濾過したものは、グラスウールからのものは少し白濁していました。一方、セラミックファイバーからのものはほぼ透明でした。しかし、グラスウール濾液も3,000rpm (1,300gくらい) x 10minの遠心でキレイに透明化でき、どちらも問題なく次のカラム結合のステップに持っていけました。
もしかすると、グラスウール・セラミックファイバーの重層にすればプランジャー押し出ししても遠心なしでキレイな濾液になるかもしれません。
これからはライセートの清澄化が楽になると思うとうれしく思います。アドバイス、ありがとうございました。

(無題) 解決済み 削除/引用
No.6508-7 - 2017/12/05 (火) 17:42:01 - ATG
APさん、TOTOさん、テクニックを伝授していただき、ありがとうございます。やってみます!

(無題) 削除/引用
No.6508-6 - 2017/12/05 (火) 17:34:34 - AP
>いや、それはSoln 3のあとフェノール抽出をしていたんですよ。

Soln 3の塩析と同時処理でしたね。とにかくフェノールクロロフォルムが入っていたのはフェノール抽出のためです。

(無題) 削除/引用
No.6508-5 - 2017/12/05 (火) 17:30:12 - AP
>これらは吸引濾過器にセットして用いるのでしょうか?それともQIA filterみたいにシリンジにセットするのでしょうか?

自然落下です。50-mLコニカルチューブの口に円錐状に押しこんでもいいでしょうし、チューブを細工してアプリケータを自作してもいいんじゃないでしょうか。
創意工夫です。

>培養スケールは100 ml程度のMidi-prepなのですが、これくらいの量でも詰まらずにいけますでしょうか?

いけると思いますが、無理そうだったら途中でフィルターを交換するとか、遠心と併用するとかしたらいいんじゃないですか。
創意工夫です。


>また、クロロホルムを入れるで沈殿しやすくさせるというアイデアも感嘆しました。Sol. IIIに入れておけばいいのでしょうか?均一に混ざりますか?

Soln. 3をいれた後に、少量たらしておく感覚です。一緒に転倒混和します。
クロロフォルムですから混じりません。沈殿が管壁に付きにくくなり、遠心すると水と僅かなクロロフォルムとの界面にパックされます。
テクニカルチップとしてけっこう知られていると思います。

>自動プラスミド調整装置でsolIIを加えてあとの沈殿を作りやすくするのに、確か、フェノールをsolIIIに少量混ぜるという方法がありました。これは水に混ざり、沈殿も固まるのでフィルターなしで遠心すればカラムにかけられます。

いや、それはSoln 3のあとフェノール抽出をしていたんですよ。
クラボウの装置の話ですよね。
普通のフェノール沈殿と違って相分離せず上清と沈殿に分かれるのが画期的なところだったんです。たぶん、RNAzolとかIsogenIIの原理と同じでフェノールと水の比率を工夫しているのでしょう。

(無題) 削除/引用
No.6508-4 - 2017/12/05 (火) 17:03:40 - toto
普通の円形濾紙(No.1など)でやってます。キムワイプだとカラムが詰まるかも。昔、自動プラスミド調整装置でsolIIを加えてあとの沈殿を作りやすくするのに、確か、フェノールをsolIIIに少量混ぜるという方法がありました。これは水に混ざり、沈殿も固まるのでフィルターなしで遠心すればカラムにかけられます。ただ、この方法、少量とはいえフェノール廃液の問題がでるので、低速遠心→濾紙で落ち着きました。シリンジの上にひだ濾紙にしてのせるだけです。

(無題) 削除/引用
No.6508-3 - 2017/12/05 (火) 16:38:01 - ATG
APさん、早速のご返答ありがとうございます。
> キムワイプ
> サラシ(海外だとcheeseclothっていうやつ)
> コーヒーの紙フィルター
これらは吸引濾過器にセットして用いるのでしょうか?それともQIA filterみたいにシリンジにセットするのでしょうか?
培養スケールは100 ml程度のMidi-prepなのですが、これくらいの量でも詰まらずにいけますでしょうか?
また、クロロホルムを入れるで沈殿しやすくさせるというアイデアも感嘆しました。Sol. IIIに入れておけばいいのでしょうか?均一に混ざりますか?
Sol. IIIを入れて中和させてから様子を見ながらクロロホルムを混ぜていくのもいけますか?
よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用
No.6508-2 - 2017/12/05 (火) 15:51:13 - AP
キムワイプ
サラシ(海外だとcheeseclothっていうやつ)
コーヒーの紙フィルター

>プラスミドを精製する時に大腸菌ライセートを遠心にて不溶物の分離しているのですが、

酢酸塩(soln III)を加えるときに、少量のクロロフォルムも入れておくと沈殿がパックして分離しやすいです。量はスモールスケールで一滴〜20 uLくらい。

フィルターによる大腸菌ライセートの清澄化 削除/引用
No.6508-1 - 2017/12/05 (火) 15:17:53 - ATG
プラスミドを精製する時に大腸菌ライセートを遠心にて不溶物の分離しているのですが、高速遠心機がないため3,000 rpmで回しており、不完全な分離になってしまっています。できればQIA filterみたいに濾過法で清澄化できたらと思うのですが、QIA filter相当品を単体で入手することはできないでしょうか?あるいは自作する方法とか、何かアイデアがありましたよろしくお願いいたします。

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