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(無題) 削除/引用 No.6517-9 - 2018/01/19 (金) 15:00:00 - プラスミド トピ主です。 すみませんバタバタしていました。 結局、N末のDKKの上流にメチオニンがないという質問でしたが、実は3xFLAGがN末についていました((殴

(無題) 削除/引用 No.6517-8 - 2018/01/19 (金) 13:44:15 - あ 結局この話題はどういうことだったのでしょう？ ただの興味本位なのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.6517-7 - 2017/12/12 (火) 14:03:43 - 中年 開始メチオニンとタグの間にイントロンの入っているベクターというのも珍しいのではないでしょうか。シークエンスは確かなのですか。

(無題) 削除/引用 No.6517-6 - 2017/12/12 (火) 12:08:41 - mon おおさんが指摘していますが、イントロンがcDNA上流に組み込んであるのではないでしょうか。 イントロンアクセプター配列のコンセンサス配列　[CT-rich配列12bp以上]-[CAG]がありませんか。

(無題) 削除/引用 No.6517-5 - 2017/12/12 (火) 11:30:19 - おお レンチウイルスベクター用プラスミドでも、プラスミドをTransfectionして一過性に発現できることがたいていです。

(無題) 削除/引用 No.6517-4 - 2017/12/12 (火) 10:49:09 - ブラスト ストップコドンに対応する三塩基まで上流を読んでいったとのことですが、そこまでどれ位の長さがあったんでしょうか？あと、そこまで読んだ配列をブラストにかけてみてはどうでしょう？

(無題) 削除/引用 No.6517-3 - 2017/12/12 (火) 10:43:21 - プラスミド おおさん、ありがとうございます。 添付されていた書類にはpCDH-CMVと書かれてありましたが、その横に、一過性発現用と書かれてありました。pCDH-CMVはレンチウイルスベクターでは？と思い、どういうことですか？と上司に聞いたところ、向こうに聞いてくださって、どうもオリジナルなpCDH-CMVではなく、改造されている、それ故にtransient expressionなんだ、という不安になるようなことを言われました。 ということで、ベクターバックボーンはpCDH-CMVではないみたいです。 先方の知らないようですね。先方もどこかからか貰ったと言っているようですので。。 挿入されている遺伝子はcDNAでした。 ゲノムを入れることも昔はあったのですね。 そして、やはりMが一般的なものであると知れて安心しました。 自分が使うマテリアルななんなのか、きちんと理解する必要があるのですが、なんだか怖いですね。。

(無題) 削除/引用 No.6517-2 - 2017/12/12 (火) 09:07:29 - おお 稀にスプライシングされるイントロンをベクターから発現するRNAのなかに入れ込むことがありますが、、、ちがうかな。また、cDNAじゃなくってゲノミックDNAをプロモーター下流に入れたコンストラクトも昔はまあまあありました。マイナーなM以外の開始コドンはあるのだけど、発現効率は低くて使えないかもしれないけど。 ベクターのバックボーン の名前はわかりませんか？

譲渡されたプラスミドに開始メチオニンが無い 削除/引用 No.6517-1 - 2017/12/12 (火) 05:04:02 - プラスミド お世話になります。 隣国からプラスミドを譲渡いただき、こちらで確認のためのシークエンスを行いました。 DYKDDDDKタグが付いているとのことでしたが、C末、N末のどちらかの情報もありませんでしたので、こちらで併せて確認をとのことでシークエンス解析したのですが、結果、DYKDDDDKタグはN末にありました。目的のタンパク質は細胞質に発現するタンパク質（60kD）です。 不思議なことにDYKDDDDKの上流に開始メチオニンは見つからず、コザックらしき配列も見当たらず、どんどん上流を見ていくとストップコドンに対応する3塩基があったので、これ以上見る意味はないかなと思い、ではどうやってDYKDDDDK融合タンパク質が発現しているのだろう？と疑問に思いました。 コザックにも開始メチオニンにも依らないタンパク質発現は、僕のこれまでの経験から初めてです。 敢えてこのようなデザインにしたのか、向こうに聞かないとわかりませんが、向こうは病院職員の方々らしくあまりサイエンスについてのバックグラウンドはないかもしれません。 私の方で293T細胞に入れたところ、きちんと発現し、抗DYKDDDDK抗体で目的の位置にバンドが検出されましたので、発現はうまくいっているようです。意図的なデザインなのでしょうか？ベクターをこちらで乗せ替える必要はないかもしれませんが、疑問に思い、質問させていただきました。 コメントやご意見ありましたら、よろしくおねがいいたします。

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