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(無題) 削除/引用 No.6532-16 - 2017/12/20 (水) 20:38:36 - mon 再生法について シリカ系スピンカラムなら、３M NaCl > DDW > 100% EtOH >乾燥 の順で洗浄してください。 残存DNAが気になる場合は、0.1M HClで数時間〜o/n処理してから（上部槽に入れて放置）洗浄してください。

(無題) 削除/引用 No.6532-15 - 2017/12/20 (水) 19:55:20 - 横 mon様 横からすみません。 このキットは使ったことありませんが、私はキアゲンのゲル抽出キットを使っています。同じようなスピンカラムでしょうか？最後の一文が気になり書き込みました。 >金欠になったら再生・再利用するかな。。 こういうスピンカラムって再利用できるのですか？もしよければ再生方法を教えくださいませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6532-14 - 2017/12/20 (水) 12:14:06 - mon ほとんどの核酸染色液はゲル溶解液中でDNAから外れるようです。 なお、溶出液のpHが８以下では効率が悪いので、注意してください。pH8.5がお薦め。 ちなみに私もMonFas使っています（pH8.5の溶出液が付いています）。washが１回で良いとか溶出液量が10-30uLで良いのが気に入っています。 金欠になったら再生・再利用するかな。。

(無題) 削除/引用 No.6532-13 - 2017/12/20 (水) 11:26:15 - GelRed >toto 様 やはり、GlRedのせいではないですよね、メーカーも問題なく使えると書いていますし。 どこかで先染めで使用すると変なことが起きるという話を聞いたので、ひょっとするとと思いましたが。 MonFas DNA精製カラム、検討したいと思います。 情報ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6532-12 - 2017/12/20 (水) 10:48:44 - GelRed >mon様 溶解液を2倍量使用したこともありますが結果は変わりませんでした。。。 溶出液のpHが重要なのですね。ミリQでなくTE等を第一選択にします。 >seventh様 確かに、ゲル抽出後は吸光度ではまともに計れない（汚いか、薄すぎる）印象を持っていたのですが、ほぼ同条件で少なくとも10ng/ul以上で回収できるはずと言っている人がいたのです。 ひょっとするとゲル抽出はこんなもんで、何か勘違いが起きてるのかも…？ >774様、おお様 抽出後サンプルの泳動はまだ確認していません。 一度試してみます。

(無題) 削除/引用 No.6532-11 - 2017/12/20 (水) 10:29:49 - GelRed 皆様ありがとうございます。 文字化けしてしまったので再投稿です。。。 >おーばーれい 様 すみません、ugでなくmgの間違いでした。。。 基本1-3min程度置いています。5分以上経っていると思われるケースでも収量は上がらなかったので、時間の問題ではないのかなと思っています。 遠心を3minにしたことはありますが、カラムの向きの調整はしていませんでした。 試してみます、ありがとうございます。 >おお様 確かに、ゲルは1%で十分ですね。 DNA濃度が薄まるのが嫌で少量で溶出していましたが、回収できなければ元も子もないので2度溶出も試してみます。 吸光度はNanoDrop2000を使用し、ブランクは適宜TE、ミリQでとっています。 バンドの濃度は、大よそですが少なくとも200ng〜多くて1ugあると見込んでいます。 15ulで溶出した場合、せいぜい5ng/ulの収量しか得られず、また別のほぼバンドが見えないサンプルを同様に抽出してみたところ3ng/ulという結果が出て、5ng/ulというのはほぼバックグラウンドなのかな、、、という感じがしています。

(無題) 削除/引用 No.6532-10 - 2017/12/20 (水) 10:26:21 - 774 PCRとか制限酵素処理した後は吸光度計で測定するよりゲルで確かめてます。 きちんと比較したわけじゃありませんが、あまり正確に測定できなかったような記憶があります。 GelRedを入れたゲルは劣化（シグナルがぼやける）が早い気がしますが、 みなさんいかがでしょうか？ （引き出しの中で光が当たらないようにはしてるのですが。） 本題とは関係なくてすみません。

(無題) 削除/引用 No.6532-9 - 2017/12/20 (水) 10:24:43 - toto さすがにGelRedがゲル抽出に向かないことはないですよ。GelRedで染めて抽出してます。ずっと前に、WizardやQuiagenや類似のカラムをつかってて、なぜか収量が低くなることがあり困って以来、片端から各社のを比べて、ジーエルのMonFas DNA精製カラムにたどり着きました。カラム担体を作ってるメーカーで、シリカですがマトリクスが特殊だそうで、他のに比べてやたら収率が高く、数十bpからすくなくとも10Kbくらいは8割以上の効率で10分もしないで取れてます。これに切り替えてからトラブったことは一度もないです。サンプルもらえると思います。

(無題) 削除/引用 No.6532-8 - 2017/12/20 (水) 10:12:18 - seventh 当方の環境（Qiagenのkit）ではPCR反応液50ulを泳動切り出しして、30ulで溶出した場合では10ng/ul程度の濃度になることが多いです。 なので分光光度計ではきれいに定量出来ない場合が多いです。

(無題) 削除/引用 No.6532-6 - 2017/12/20 (水) 09:12:32 - mon ゲルの濃度に応じて溶解液は増やすべきです（1%ゲルが標準なので、1.5%なら1.5倍）。とはいっても溶けているので問題なさそう。 また溶出液はDDWではなく（保存中に弱酸性になり溶出効率が著しく落ちる）、pH8.5の5-10mM TrisHCl(+0.1mM EDTA)が良いです。

(無題) 削除/引用 No.6532-5 - 2017/12/20 (水) 05:03:56 - おお 吸光度はどのようにして計ってますか？

(無題) 削除/引用 No.6532-4 - 2017/12/20 (水) 05:00:48 - おお バンドの強さからの収量の見積もりはどの程度でしょうか（マーカーとかから比較して）？ その吸光度で測れなかったというサンプルを電気泳動してバンドが確認されるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6532-3 - 2017/12/20 (水) 04:52:13 - おお ゲルはそのサイズだったら１％でもよさそう。溶出は従来の６、７割の量にして２度抽出。 誰か遠心の温度を４度とかでやると収率が悪いとか言ってなかったかなと思ったのですが、それは定かじゃありません。

(無題) 削除/引用 No.6532-2 - 2017/12/20 (水) 03:09:03 - おーばーれい 100-200ugではなく、mgですよね？ ＞FTを除いた後に追加で1min遠心して完全にバッファを除いています。 確信はありませんが、チューブをくるっと180回転させて、もう2分遠心してみてはどうやろか。 溶出液はキット付属のものですか？溶出液を加えた後、待っていますよね？

PCR産物のゲル抽出の回収量が少ない 削除/引用 No.6532-1 - 2017/12/20 (水) 02:44:43 - GelRed いつも勉強させていただいています。 タイトルの通り、PCR産物のゲル抽出の回収量が非常に悪く困っております。 PCR産物をアガロースゲル電気泳動し約500bpの断片を市販のkitで抽出し、吸光計で収量を測定したところほぼ全く濃度が出ない状況です。 バッファはTAE、ゲルは1.5%アガロースゲル、染色はGelRedで後染めして、 切り出しはDNAにダメージを与えない青緑色LEDイルミネーター下で行っています。 十分にはっきりと視認できる濃さのバンドを切り出し（約1cm幅、100-200ugのゲル重量）、QIAGENのQiaquick、プロメガのWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemの2種のキットを試しましたがどちらも終了が低く… ゲル溶解のバッファは規定量通りか若干多めに使用し、50-60℃で溶解する際も目視で完全に溶けた後も2,3分追加でインキュベートしています。 もちろんwash bufferには予め規定量のエタノールを加えていますし、wash後はFTを除いた後に追加で1min遠心して完全にバッファを除いています。 現状自分で考えられるのはひょっとするとGelRedがゲル抽出に向かないのかも…？ということぐらいしか思いつかず非常に困っています。 もし何かありましたらどんなことでも構わないのでアドバイス頂けないでしょうか。 よろしくお願いします。

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