平素は勉強させていただいております。
私はある受容体Xに興味を持っています。
これまでのその受容体XにはYというリガンドが結合することが知られていますが、それ以外のリガンドについては数報の報告はあるものの、in vivoでの証明という観点から言うと、2つ以上のリガンドがあることはまだ証明されていません。
そこで本格的に受容体を同定しようと考えています。
ただ、そのような実験は私は初めてで、色々文献等読みながら進めていますが、いくつかわからない点がありまして、ご相談させていただきたいです。
XとYとの結合には糖鎖が関与しますが、それはY側の糖鎖であり、Xの組み換えタンパク質を大腸菌で作らせても哺乳動物で発現させたYとは結合することが知られています。
そこで、Xを大腸菌で発現させようと考えています。（もちろん未知のリガンドとの結合にXの糖鎖が必要かどうかはわかりませんが。。）
一つ目の質問は、アフィニティクロマトグラフィを作製することを目的として、使用するタグのことです。
MBPやGSTタグを使用して融合タンパク質を作製している論文をよく見ました。
可溶性タンパク質として発現させるために有効であることは存じ上げていますが、アフィニティクロマトを作製する際にはどちらがいいかなどありますでしょうか？たとえば、ヒスタグーニッケルカラムの場合には、おそらく内在性のポリヒスチジンがベタベタカラムにトラップされるなど聞きます。どちらのラグでは非特異的吸着がないなどありますでしょうか。
二つ目の質問は、アフィニティクロマトを作製する際、リガンドが含むかもしれないタンパク質抽出液として、細胞のライセートがまず考え付きますが、それ以外にもマウスやその他動物種の組織抽出液も用いられると学びました。結合タンパク質がごくわずかな場合、たくさんのタンパク質を調整するためマウスなど組織からタンパク質抽出物を調製した方がいいのかなと思っています。ですが、どの組織を用いるべきかという点において答えが出ません。これはやはり色々な臓器を試すしかないのでしょうか？あるいは、ある組織は色々な細胞で構成されているのでこの臓器でまずやってみたら？というのがありますでしょうか？例えばほぼ骨格筋細胞から成る筋肉よりは、消化管でやるべきなど。
ざっくりとした質問内容で恐縮ですが、どうかコメントいただけますと幸いです。 |
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