乙さんの４ですが、SDSPAGEでサンプルがスタッキングゲルをまたいだところで止めると、速くすみますしバンドが広範囲にあってバックグランドとか設定しにくいというのを避けられます。
ドットかスロットブロットして膜をポンぞーなどで染めて定量という事もできるかと思いますが、サンプルバッファーのSDSがちょっと高濃度すぎると思いますので適切なバッファーに薄める必要があるでしょう。まあ数マイクログラムもあれば十分なので、ボリュームも数マイクロLくらいだろうから希釈しても方法論的にはありえるボリュームになるでしょうけど。
ちょっと前の質問で泳動し、（多分転写後）に蛍光でグローバルスタンダダイズする方法が示されてましたけど。
分子量的にはゲルろ過（スピンカラムとか）って使えないだろうか、、、色素が抜けてもSDSはどうかなというのはあるし、抜けないほうがカラムにつまらなくていいのだけど（なので０.１％は入れておきたい気がするがかといってすべての蛋白が抜けてくるかというと保証はできない）、ブラッドフォードが使いにくいし、BCAは通常のやつはメルカプトエタノールがねぇ。。。これも分子量的には抜けそうだけど結構な量入ってるし。たしかに界面活性剤除去処理をしてブラッドフォードができるキットもあるようだし、還元剤が入っていても前処理で図れるようになるキットもあるけどね。
もっと面倒な方法は一度アセトンなどで沈殿して、再溶解。再溶解は６％Ureaでなるべく加熱などはさけて、すぐ使うならこれが溶解するのにベストと思っている。BCAが使えるし。 |
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