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FBS入りの培養上清からhIgG2-Fc融合タンパク質の精製 トピック削除
No.6568-TOPIC - 2018/01/10 (水) 13:37:46 - コン
いつも勉強させていただいております。

私の実験の片手間に先生からCOS-7の培養上清1Lを渡されました。
この上清にはhIgG2-Fc融合タンパク質が含まれているようですが、もしかしたらFBSが入っているかもしれない。と言われてしまいました。

thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/binding-profiles-of-protein-a-and-protein-g.html

Bovine: Protein A+, Protein G++

biosyn.com/tew/binding-comparison-between-protein-a-protein-g-protein-a-g-and-protein-l.aspx

Cow: Protein A weak, Protein G strong

rockland-inc.com/prot_a-g_bind.aspx

Bovine: Protein A weak, Protein G strong


3つのサイトを比較すると、hIgG2ではプロテインAもGも同程度強い結合を示すが、ウシのIgGではプロテインAはGに比べ弱い結合を示すようです。このことから、もしかしたらプロテインAビーズを使って、目的のものをなんとか選択的に回収できないか考えていますが、実際うまくいくものでしょうか？

過去に挑まれた方がいらっしゃましたらシェアしていただけますと幸いです。
よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.6568-12 - 2018/01/12 (金) 07:26:36 - mon
GIT培地の肩を持つわけでは無いけど、無血清培地だと思って使っている研究者はいないと思いますよ。Toさんが紹介されているような精製法もありますし。

GIT培地は細胞増殖に優れた無血清培地がまだ無くFBSもロット差が激しかったころに日本人が開発した培地で、様々な細胞の増殖をサポートしたpremixed培地として便利です（した）。ただし海外では見かけないかも。。
ハイブリドーマ培養で多用されるのも、モノクロ作製が広まりつつあるころ（それ以前か？）に開発されて、ロットチェックが不要・抗体収量も多い（悪くない）・ハイブリドーマが安定（抗体産生能が落ちにくい）等の利点があるからです。
今だとIL6が添加された優れた無血清培地があるし、海外のmethod本ではGIT培地は見かけないので、新規にモノクロ作製を覚える方は使わないかも。。

で、紹介しておいて申し訳ないですが、私もGIT培地は永らく使っていません。でもフリーザーに1本凍結保存してあります。
一過性発現による分泌タンパクの産生にはCOS細胞よりも（浮遊）CHO細胞+無血清培地をお勧めします。どうしても血清を使う場合は高価ですが精製過程での面倒が少ないので（超）低IgG血清をお薦めします。

(無題) 削除/引用
No.6568-11 - 2018/01/11 (木) 19:40:52 - To
やったことはないけど、bovine IgGはProtein Aから比較的高いpHでもelutionされるので、pHの異なる2段階elutionで分けられるというのはいろいろなところで見たことがある。検索掛けたらたくさんあるかもしれない。これとか。
https://books.google.co.jp/books?id=7zVYOXB6VCIC&pg=PA49&lpg=PA49&dq=Protein+A,+bovine+IgG,+pH&source=bl&ots=XYzoKukuap&sig=tfZfvz-eFfr3yrsjNx8ygpUQjDw&hl=ja&sa=X&ved=0ahUKEwia0pnK2s_YAhWCJJQKHUDPDG0Q6AEIYTAH

GIT培地は勧められない 削除/引用
No.6568-10 - 2018/01/11 (木) 19:30:34 - To
GIT培地はなぜか（Wakoが出しているからだろうが）日本でハイブリドーマの培養に好んで使う方が多いのですが、serum-free mediumと勘違いして使用している人もいると思います。しかし、GIT培地はしっかりbovine IgGをしっかり含んでいます。
（以下引用）
http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/life/article/git_qa.htm
GIT1ml中に10μg程度のIgGが含まれています。
(一般のFBSにはIgGが200〜300μg程度含有されており、FBSを10%濃度で使用した場合、培地1mlあたりのIgG量は20〜30μg程度になります。

(無題) 削除/引用
No.6568-9 - 2018/01/11 (木) 17:17:05 - コン
APさま、いえいえ(^^)v
APさまの書き込みにはいつも勉強させていただいております。
ありがとうございます！

(無題) 削除/引用
No.6568-8 - 2018/01/11 (木) 16:25:40 - AP
そうか！　こりゃうっかり。

(無題) 削除/引用
No.6568-7 - 2018/01/11 (木) 16:20:48 - コン
AP様、

ありがとうございます！
Protein Lは、Protein AやGとは異なり、Fcへは結合しませんよね？
確かFabだったと思います。

私のFc融合タンパク質はFabは持っておらず、ウシIgGと共通なのはFc部位だけですので私がきちんと理解できているのならたぶんProtein Lでは目的に合わないかと思います。。。どうなんでしょうね。


>[Re:6] APさんは書きました :
>
> > そうですね、プロテインLも考えたのですが、bovineには結合しないようでした。
> > お示しいただいた表でも、cowはnegative bindingとなっていますね。
> > 抗ウシ抗体をimmobilizeしたビーズで吸収を考えていました。
>
> わたしがなにか勘違いしているのかもしれないけれど、
> hIgG2-Fc融合タンパク質を選択的にProtein Lにくっつけて、BovineのIgGは洗い流しちゃえばいいんじゃないの？
>

(無題) 削除/引用
No.6568-6 - 2018/01/11 (木) 16:18:16 - AP

> そうですね、プロテインLも考えたのですが、bovineには結合しないようでした。
> お示しいただいた表でも、cowはnegative bindingとなっていますね。
> 抗ウシ抗体をimmobilizeしたビーズで吸収を考えていました。

わたしがなにか勘違いしているのかもしれないけれど、
hIgG2-Fc融合タンパク質を選択的にProtein Lにくっつけて、BovineのIgGは洗い流しちゃえばいいんじゃないの？

(無題) 削除/引用
No.6568-5 - 2018/01/11 (木) 15:26:50 - コン
mon様、ありがとうございます。

確かに培養上清に含まれるものはウシIgGに比べ圧倒的に少ないと思います。。

GIT培地というものがあるのですね。
今見ているサイトとしては、VP-SFM (1X) - Thermo Fisher Scientificというものがありますね。
GITの方が増えは良さそうな気がしますね。ありがとうございます。

ありがとうございます。
はい、FlowThrouhは捨てないで、イオン交換でどの程度分離できるか試してみます。
ありがとうございました。



>[Re:2] monさんは書きました :
> COS細胞上清からの経験はありませんが、上清中のhIgG2-Fc融合タンパク質の濃度が薄いとprotein Aカラムでも収率が悪くなります。濃縮が必要になるかも。
> 濃度が濃いと優先的にhIgG2-Fcが結合しますが、それでもウシIgGの混入はあります。
> GIT培地だといきなりprotein Aカラムでも面倒が少ないのですが。。。
> FBSが入っていると濃縮も厄介ですので、安価なDEAEセルロース等で簡易濃縮（部分精製）が早道かも。
> とりあえず、FlowThrouhは捨てないで目詰まりに注意しながらprotein Aカラムを通してみては。。

(無題) 削除/引用
No.6568-4 - 2018/01/11 (木) 15:21:48 - コン
AP様、ありがとうございます。

そうですね、プロテインLも考えたのですが、bovineには結合しないようでした。
お示しいただいた表でも、cowはnegative bindingとなっていますね。
抗ウシ抗体をimmobilizeしたビーズで吸収を考えていました。

(無題) 削除/引用
No.6568-3 - 2018/01/11 (木) 14:41:43 - AP
Protein Lとか、
http://www.funakoshi.co.jp/contents/80001

(無題) 削除/引用
No.6568-2 - 2018/01/11 (木) 13:34:06 - mon
COS細胞上清からの経験はありませんが、上清中のhIgG2-Fc融合タンパク質の濃度が薄いとprotein Aカラムでも収率が悪くなります。濃縮が必要になるかも。
濃度が濃いと優先的にhIgG2-Fcが結合しますが、それでもウシIgGの混入はあります。
GIT培地だといきなりprotein Aカラムでも面倒が少ないのですが。。。
FBSが入っていると濃縮も厄介ですので、安価なDEAEセルロース等で簡易濃縮（部分精製）が早道かも。
とりあえず、FlowThrouhは捨てないで目詰まりに注意しながらprotein Aカラムを通してみては。。

FBS入りの培養上清からhIgG2-Fc融合タンパク質の精製 削除/引用
No.6568-1 - 2018/01/10 (水) 13:37:46 - コン
いつも勉強させていただいております。

私の実験の片手間に先生からCOS-7の培養上清1Lを渡されました。
この上清にはhIgG2-Fc融合タンパク質が含まれているようですが、もしかしたらFBSが入っているかもしれない。と言われてしまいました。

thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/binding-profiles-of-protein-a-and-protein-g.html

Bovine: Protein A+, Protein G++

biosyn.com/tew/binding-comparison-between-protein-a-protein-g-protein-a-g-and-protein-l.aspx

Cow: Protein A weak, Protein G strong

rockland-inc.com/prot_a-g_bind.aspx

Bovine: Protein A weak, Protein G strong


3つのサイトを比較すると、hIgG2ではプロテインAもGも同程度強い結合を示すが、ウシのIgGではプロテインAはGに比べ弱い結合を示すようです。このことから、もしかしたらプロテインAビーズを使って、目的のものをなんとか選択的に回収できないか考えていますが、実際うまくいくものでしょうか？

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よろしくお願いします。
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