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大腸菌組み替えタンパク質とIPTG トピック削除
No.6569-TOPIC - 2018/01/10 (水) 14:54:53 - mori
実験初心者です。皆様のご意見を伺えればと思います。

大腸菌組み替えタンパク質を培養し、IPTGを加えているときと、加えていない時でどの程度、収量の差があるかを確認しています。
本来ならIPTGを加えてない方が生育に負荷がかからず、IPTGを加えたら生育に負荷がかかり封入体とかになりやすいのでしょうか?

今回実験をした際に、IPTGを加えていない時の方が収量が低く、IPTGを加えている方が収量が高かったので、プラスミドが挿入されていないのではないかと考えました。
 
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(無題) 削除/引用
No.6569-14 - 2018/01/11 (木) 10:59:29 - おお
>IPTGは発現誘導をかける為におこなっていると考えています。

ではその誘導のメカニズムはなんでしょうか?プラスミドが出てきたりなくなったりするような仕組みが関与してういますか?

(無題) 削除/引用
No.6569-13 - 2018/01/11 (木) 10:38:34 - mori
IPTGは発現誘導をかける為におこなっていると考えています。

(無題) 削除/引用
No.6569-12 - 2018/01/11 (木) 08:34:24 - OMG
> 今回実験をした際に、IPTGを加えていない時の方が収量が低く、IPTGを加えている方が収量が高かったので、プラスミドが挿入されていないのではないかと考えました。

意味がよくわからないです。上記のように考えているということは、IPTGを加えていない時の方が収量が高くなっていた場合にプラスミドが挿入(?)されている、ということになるのですか?

> 前培養をしてある程度菌を増殖している状態で、本培養を開始し、IPTGを添加したら、大腸菌に負荷がかかり生菌数が下がると思いました。

一体、なぜIPTGを添加しているとお考えなんでしょうか?
IPTGの添加による負荷で生菌数が減り、タンパク質の収量が下がる蓋然性が高いというのであれば、IPTGを加える必要なんてないのではないですか?
ひょっとして単に大腸菌にストレスを与えてその影響を調べるための薬剤だと考えているということでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.6569-11 - 2018/01/11 (木) 01:51:07 - おお
で直接大腸菌が死ぬことはなかろう。リコンビナントを合成するという観点ではIPTGの役割について負荷とかは重要ではない。

(無題) 削除/引用
No.6569-10 - 2018/01/10 (水) 20:51:44 - mori
皆さんありがとうございます。

大腸菌株はBL21(DE3です。pet29bのベクターを使っています。

前培養をしてある程度菌を増殖している状態で、本培養を開始し、IPTGを添加したら、大腸菌に負荷がかかり生菌数が下がると思いました。

(無題) 削除/引用
No.6569-9 - 2018/01/10 (水) 18:38:23 - AP
>本来ならIPTGを加えてない方が生育に負荷がかからず、IPTGを加えたら生育に負荷がかかり封入体とかになりやすいのでしょうか?

普通は増殖中にはIPTGを入れません。規定の菌濃度にまで増殖してからIPTGで誘導をかけます。IPTGを入れてからの培養は増殖がではなく、既存の菌体の個かでタンパク質が発現してくれればいいんです(実際は増殖も多かれ少なかれ起こるけど)。

(無題) 削除/引用
No.6569-8 - 2018/01/10 (水) 18:29:42 - AP
あなた、原理も分からずに実験してるわけ?

そもそもIPTG誘導系ならば、IPTGをいれたときにのみ発現が起こるようになっている。理想的にはIPTGがないときはいっさい発現しないようになっている。実際は、生き物のことだからそんなに全か無かにはならなくて、IPTGのないときにもleaky expressionがある。そこをいろいろ工夫してよりオンオフのキレをよくしようとしたのがpETでT7 RNA polをかませた系だったりするんだが。

だから、
>IPTGを加えていない時の方が収量が低く、IPTGを加えている方が収量が高かったので、
あったりまえじゃーん。
発現誘導したときに封入体にいくか可溶画分に残るかはまた別の話。
封入体にしたくないとき、発現が強すぎると封入体になりがちなので、IPTGの濃度を下げる、というひとつの対策があるということ(対処法はこれだけではないし、効果が得られるかもケースバイケース)。

(無題) 削除/引用
No.6569-7 - 2018/01/10 (水) 17:41:01 - mon
「大腸菌組み替えタンパク質を培養し」:用語の使い方が間違えていますよ。
「組換え」タンパク質は培養出来ません。培養するのは大腸菌です。
pETベクター系なら用いる大腸菌菌株によっても発現挙動が異なるので、質問する場合は明記してください。

(無題) 削除/引用
No.6569-6 - 2018/01/10 (水) 17:36:42 - mon
日本語マニュアルくらい読みましょうね。
ttp://www.ritsumei.ac.jp/~h-matsu/38_pET.pdf
ttps://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9102/9102_yomoyama_1.pdf

(無題) 削除/引用
No.6569-5 - 2018/01/10 (水) 17:00:45 - mori
使用したプラスミドはpetベクターを用いました。

(無題) 削除/引用
No.6569-4 - 2018/01/10 (水) 16:09:09 - おお
プラスミドが挿入されていないのに発現が誘導できるの?使ったプラスミドは何?

(無題) 削除/引用
No.6569-3 - 2018/01/10 (水) 16:01:29 - mori
前培養でOD=0.6付近で、本培養に移しています
なので誘導期を本培養の際には抜いている形になります。

(無題) 削除/引用
No.6569-2 - 2018/01/10 (水) 15:09:24 - おお
ヒント:発現誘導

大腸菌組み替えタンパク質とIPTG 削除/引用
No.6569-1 - 2018/01/10 (水) 14:54:53 - mori
実験初心者です。皆様のご意見を伺えればと思います。

大腸菌組み替えタンパク質を培養し、IPTGを加えているときと、加えていない時でどの程度、収量の差があるかを確認しています。
本来ならIPTGを加えてない方が生育に負荷がかからず、IPTGを加えたら生育に負荷がかかり封入体とかになりやすいのでしょうか?

今回実験をした際に、IPTGを加えていない時の方が収量が低く、IPTGを加えている方が収量が高かったので、プラスミドが挿入されていないのではないかと考えました。

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