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(無題) 削除/引用 No.6589-7 - 2018/01/17 (水) 22:36:10 - １２３４５６７８９０ そうですね。私自身は経験ないですが分泌させる方法ならばいいですね。血清が精製のネックになりますが無血清でいけるかどうか(それが合成／分泌に影響するかどうか)とか、あるいはHis-tagによる精製が培地成分の影響をうけるとかいった細かなことが検討課題になるかもしれないですね。 均一に浮遊すればいいのでスターラーバーでもいいとおもいますが、ただ、スターラーバーだとバーとフラスコの底面の間に細胞が潜ってしまうとすりつぶされたりとかするかもしれないですね。スピナーフラスコはたしか（もう長い事使ってないのであやふやですが）回転子が底面から少し浮いていますよね。

(無題) 削除/引用 No.6589-6 - 2018/01/17 (水) 19:20:06 - mon >[Re:5] 棚橋さんは書きました : > 僕も今Expi293Fに興味があります。 > スピナーフラスコで培養するみたいですが、これって、オートクレーブした500 ml ビンにメディウムを入れ、下にマグネティックスターラーを旋回させるだけじゃ培養できませんかね？ 経験はありませんが、出来ると思います。液量は150mL程度が限界かも。。。 スターラーバーで細胞が壊れることがある、とどこかで読んだことがあります。でも増殖の方が早いのでさほど問題にならないかと。。 フロート撹拌子を使えばよいとは思いますが、高価ですね。。 ttps://axel.as-1.co.jp/asone/d/7-222-01/ CO2インキュベーターにいれるスターラーは（当たり前ですが）防湿でないと機器内部がサビます。安いの使って後悔した経験あり（茶色いサビ液の掃除が。。。）

(無題) 削除/引用 No.6589-5 - 2018/01/17 (水) 16:54:26 - 棚橋 僕も今Expi293Fに興味があります。 スピナーフラスコで培養するみたいですが、これって、オートクレーブした500 ml ビンにメディウムを入れ、下にマグネティックスターラーを旋回させるだけじゃ培養できませんかね？ スピナーフラスコって高いんで・・

(無題) 削除/引用 No.6589-4 - 2018/01/17 (水) 13:17:34 - おお １２３４５６７８９０さんのコメントは細胞内の発現系ですか？２９３Tなどを使った分泌させる合成系は比較的うまくいくという話は聞きます。

(無題) 削除/引用 No.6589-3 - 2018/01/17 (水) 11:59:15 - １２３４５６７８９０ 培養細胞に発現させる系は大腸菌や酵母のような大量発現が困難ですので（不必要なへんなものは細胞内に溜まらないような合成／分解の品質管理機構が発達しているからとおもいます）、量を確保するということが重要ならばあまり適切ではない気がします。大量培養するにしても、培地や血清のコストがかかりますし、ローラーボトルを使用するかもしれませんがそのスペースや設備の問題もあるし。また精製するにしても大腸菌のときとことなりアフィニティー精製しても非特異的な蛋白質が多く混入してしまい、容易ではありません。 昆虫細胞で発現／精製したリコンビナント蛋白質は市販品でもときどきみるのでいいかもしれませんね。 ほ乳類や植物の細胞内成分を使った無細胞系の大量蛋白質合成も最近、研究技術が進んでいて、それ専門の研究センタ―を持つ大学もあったとおもいます。検討ください。

(無題) 削除/引用 No.6589-2 - 2018/01/17 (水) 08:52:09 - mon バキュロウイルスを用いた組換えタンパクの糖鎖付加に関する課題は以下を参照 ttp://seisan.server-shared.com/642/642-56.pdf ttp://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9306/9306_tokushu_4.pdf バキュロウイルスが実験室レベル（〜数10mg)での組換えタンパク産生で用いられなくなった（なってきた）理由は、私の経験からは以下のようです。 組換えタンパク産生が目的ではなく、それを使った研究が目的なので「組換えタンパク産生」に手間をかけたくないのが一番かと。とくに最近は多種(変異体、相互作用するタンパク等）を同時に用意する必要もあるので、個別に条件検討なんて面倒。。 「」内は浮遊培養系。具体的には、 バキュロウイルス作製までの時間が掛かる「発現ベクターにクローン化するだけ」。 （比較的難しいと予想されるタンパクを試行するため）まあまあの確率で可溶性発現が得られない〜収量が想定より少ない。 「CHO, HEK293浮遊大量培養用の培地（kit)の性能が良くなり手軽に収量が大幅アップ＝目的の収量（〜数10mg)程度なら一過性発現法で最適化不要。」 「費用も~20万円程度で2~3週間でOK＝一見高価であるが費用対効果（人件費等）・失敗率・時間を考えると安価」 培地だけ購入してPEI-MAX等で安価に済ます方法もあります。。

タンパク質の作り方の系の違い。 削除/引用 No.6589-1 - 2018/01/17 (水) 02:00:45 - 実験初心者 研究室に入りたての初心者で、タンパク質を作ったりする研究室に所属しました。 翻訳後修飾を持つようなタンパク質だと、大腸菌は選択肢から除かれると思います。 そこで、酵母、昆虫細胞、哺乳類の細胞（接着または浮遊）があるかと思います。（小麦などもあるようですけど、、、） 過去の文献を見てみると、バキュロウイルスを使った昆虫細胞でタンパク質を作製している論文を多く見ましたが、最近は（？）それよりかは浮遊の293Tなどを用いて大量（1mg）に作製している論文を多く見かけました。 先生は私に実験のプランをたてされてくれるようで、色々考えているのですが、細胞を扱う実験室なので酵母は除外するように、と言われています。（培養室が汚染されることがあるみたいで、、、） そこで昆虫細胞か、哺乳類細胞（接着または浮遊）を考えています。 Sf9やHi5のような昆虫細胞だと翻訳後修飾もあり（実際の望んだものであるかは問題ですが）、大量発現も期待できそうです。またバックミドを導入する際の最初のトランスフェクション試薬さえあれば、とても安価にタンパク質ができるのではと思います。 一方の哺乳類細胞（293Tやチャイニーズハムスターオバリー、コス細胞）などでは割と望んだ翻訳後修飾が期待できそうですが、高価な遺伝子導入試薬も毎回必要だと思います。浮遊用のガラス製の旋回する培養器？は研究室にあり、昆虫、哺乳細胞のどちらでも大丈夫のようです。 ただ先生からは翻訳後修飾されたものを大量発現でき、安価であることを条件として出されています。 そうなると昆虫細胞がいいのかなと思いますが、私の懸念は最近の論文ではバキュロウイルス系でのタンパク質を作製している論文をみかけなくなったということで、何か問題や、浮遊の哺乳細胞の方がメリットが多いなどの理由があるのではと思ってしまいました。 先生から聞けばいいのですが、この掲示板で質問することでもう少しいろんな方のご意見を聞けたらなと期待しました。ググレカスレベルの話だと思いますが、教えていただけるとうれしいです。

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