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(無題) 削除/引用 No.6590-4 - 2018/01/18 (木) 11:01:41 - 初心者 AP様 mon様 大変勉強になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6590-3 - 2018/01/17 (水) 19:55:19 - AP 本題ではないですがプラスミドから2周回った産物ができたからよいうより、overlap extension PCRになったというほうが可能性が高いでしょう。多分サイクルが過剰でPCR産物が混み合ってきて、プライマーがアニールするんじゃなくて産物同士が末端の相同配列でアニールして伸長する反応が起こりやすくなってたんでしょう。 二周回るというおそらく稀なことが起こり、倍も長くて増幅効率にハンディがある副反応が起こったと考えるよりありそうでしょ。 プラスミドのタンデム二量体をもつクローンには、目的の組換え体をスクリーニングしているなかで出会ったことがあります。まあ、分子内にもろ相同配列が共存しているので安定ではないでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.6590-2 - 2018/01/17 (水) 19:11:09 - mon タンデムリピート（順向き）でしょうから、普通に12kbpのplasmidとして複製されますよ。 通常のplasmidもまれに2量体化して（安定に1量体と共存して）複製されることもあります。

複製起点を２つ持つプラスミド 削除/引用 No.6590-1 - 2018/01/17 (水) 18:21:35 - 初心者 私は、プラスミド上のある一箇所の配列を削除しようとしています。 実験手順は以下の通りです。 まず、プラスミドの削除したい配列の両端にアニールするプライマーを使ってインバースPCRする。 リニアになったプラスミドの両端をin-fusionで繋げ、環状に戻す。 ※インバースPCRの際に使う、各プライマーの3'末端側には、in-fusion用に、相補的な配列の"のりしろ"を設けてあります。 インバースPCR産物は6000 bpになるはずでしたが、電気泳動で確認すると6000 bpと12000 bpの位置にバンドが現れました。12000 bpの断片は、おそらくインバースPCRが2周してできたのだと考えましたが、これだと、このプラスミドは複製起点を2つ持つことになると思います。このプラスミドは、形質転換後、菌内ではどのように複製されていくのでしょうか。

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