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Chemiluminescence基質のシグナルのkinetics トピック削除
No.6598-TOPIC - 2018/01/19 (金) 11:13:04 - BM chemi
いつも参考にさせていただいています。
ELISAで用いるHRP酵素用のChemiluminescence基質について質問させてください。

あるタンパク質の濃度を高感度かつ広いレンジで検出するELISA系の構築を試みており、
感度向上のためChemiluminescence基質を検討しています。
測定サンプルは貴重なので、まず段階希釈したHRP標識抗体に基質液を添加して測定し、
基質の感度と経時的なシグナルの変化をおおまかに把握してみました。
すると、
・HRP濃度とシグナルが相関しない
・経時的に各HRP濃度間でのシグナルの大小関係が変化する
という解釈しがたい結果となってしまいました。

たとえば「持続的に高いシグナルを示すHRP濃度」より3倍高いHRP濃度では「初期シグナルが低く経時的にゆっくりとシグナルが上昇する」という挙動を示します。
測定したいサンプルの濃度は10倍以上の濃度差があると予想されるため、測定系の適切なレンジから外れていた場合
濃度の測定どころか大小関係さえ間違った結果が出てしまうのではないかと心配しています。
実際にサンプルを測定して様子を見るしかないのかとは思いますが、貴重なサンプルを使うことを躊躇しています。
自分も若干混乱しており、文字では説明が難しく何を言っているのかいまいち伝わらないかもしれませんが
Chemilumi基質の使用は初めてのため、こういった基質の基本的な取り扱いの注意、レンジの見極め、採用するタイムポイントの見極め等何かアドバイスいただけないでしょうか？


もう少し詳細に説明すると以下のような結果でした。
反応初期において、
・HRP濃度が一定までは濃度に比例してシグナルが上昇するが、ある濃度（Xとします）を超えると反比例してシグナルが低下する
結果になりました。
また各HRP濃度について経時的な変化を見ると、
・高濃度のHRPでは初期シグナルが濃度に反比例して低くなるが、経時的にシグナルが上昇していく
・さらに、高濃度のHRPではシグナルがピークに達すると、経時的にシグナルが低下してく
・一方、中程度の濃度では初期からピークのシグナルを示し、経時的に非常に緩やかに低下していく
・経時的なシグナル上昇の速度は濃度が高いほど急速なため、経時的にHRP濃度間のシグナルの大小関係が入れ替わる
　
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(無題) 削除/引用
No.6598-3 - 2018/01/19 (金) 16:56:14 - AP
>・高濃度のHRPでは初期シグナルが濃度に反比例して低くなるが、経時的にシグナルが上昇していく

ウエスタンでみられる「白抜け」のようなことが起こっているのかも。
高濃度のHRPのスポットでは、スポット縁辺部の酵素が基質を使い尽くしてしまって、スポット中心部に基質が届かず全く反応に寄与しないからだって言われている。

(無題) 削除/引用
No.6598-2 - 2018/01/19 (金) 13:24:27 - AP
HRPの反応は一般に、瞬間的に立ち上がって短時間で減衰するものです。
短時間で爆発的に反応が起こるのでそれなりの検出系でなければシグナルが飽和してしまうかも。反応で生じるラジカルが酵素を失活させていくので、HRPが多いほど失活の影響が大きくなるという要因もあります。
なのでKineticsを取るのは難しそう。

反応液にスカベンジャーを入れたり反応速度の調整剤を入れたりして、発光寿命を長くしたり、爆発的ではなく中庸な反応を持続的にしたりする、モディファイされた基質液が各社から色々出ていますけど、そう言うの使っても定量性は難しかろう。

おすすめするのは、HRPではなくAlkaline phosphatase（AP）を使う方法。
CDP-starやCSPDなどの発光基質で長時間プラトーな発光をえられて定量性がよい。微弱なシグナルでも、露光時間を長くして検出するという方法が取れる。

Chemiluminescence基質のシグナルのkinetics 削除/引用
No.6598-1 - 2018/01/19 (金) 11:13:04 - BM chemi
いつも参考にさせていただいています。
ELISAで用いるHRP酵素用のChemiluminescence基質について質問させてください。

あるタンパク質の濃度を高感度かつ広いレンジで検出するELISA系の構築を試みており、
感度向上のためChemiluminescence基質を検討しています。
測定サンプルは貴重なので、まず段階希釈したHRP標識抗体に基質液を添加して測定し、
基質の感度と経時的なシグナルの変化をおおまかに把握してみました。
すると、
・HRP濃度とシグナルが相関しない
・経時的に各HRP濃度間でのシグナルの大小関係が変化する
という解釈しがたい結果となってしまいました。

たとえば「持続的に高いシグナルを示すHRP濃度」より3倍高いHRP濃度では「初期シグナルが低く経時的にゆっくりとシグナルが上昇する」という挙動を示します。
測定したいサンプルの濃度は10倍以上の濃度差があると予想されるため、測定系の適切なレンジから外れていた場合
濃度の測定どころか大小関係さえ間違った結果が出てしまうのではないかと心配しています。
実際にサンプルを測定して様子を見るしかないのかとは思いますが、貴重なサンプルを使うことを躊躇しています。
自分も若干混乱しており、文字では説明が難しく何を言っているのかいまいち伝わらないかもしれませんが
Chemilumi基質の使用は初めてのため、こういった基質の基本的な取り扱いの注意、レンジの見極め、採用するタイムポイントの見極め等何かアドバイスいただけないでしょうか？


もう少し詳細に説明すると以下のような結果でした。
反応初期において、
・HRP濃度が一定までは濃度に比例してシグナルが上昇するが、ある濃度（Xとします）を超えると反比例してシグナルが低下する
結果になりました。
また各HRP濃度について経時的な変化を見ると、
・高濃度のHRPでは初期シグナルが濃度に反比例して低くなるが、経時的にシグナルが上昇していく
・さらに、高濃度のHRPではシグナルがピークに達すると、経時的にシグナルが低下してく
・一方、中程度の濃度では初期からピークのシグナルを示し、経時的に非常に緩やかに低下していく
・経時的なシグナル上昇の速度は濃度が高いほど急速なため、経時的にHRP濃度間のシグナルの大小関係が入れ替わる
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