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(無題) 削除/引用 No.6608-9 - 2018/01/24 (水) 06:55:58 - おお 界面活性剤が入っているならNaClなど高い濃度でデタージェントが相分離したり沈殿することがあるので予め確認してみてください。LiClは大丈夫かなという気がしますが確認しておいたほうが無難でしょう。

(無題) 削除/引用 No.6608-8 - 2018/01/23 (火) 17:11:01 - SYBR master なら、別にGST単体は残っていても良いんじゃないでしょうか？Afi.chro用のbaitなら、GSTそのものは結果に影響を与えないんじゃ無いかと。GST単体に引っかかるようなら、baitのGST-fusionにも引っかかると思うし。 >[Re:6] 火星の人さんは書きました : > SYBR masterさん、 > > ありがとうございます。 > それも最初考えたのですが、アフィニティクロマトグラフィー用のbaitを作りたかったので、GSTタグは残しておきたいんです。。 >

(無題) 削除/引用 No.6608-7 - 2018/01/23 (火) 06:31:34 - 火星の人 おおさん、ありがとうございます。 そのような工夫は思いつきませんでした。今、昨日イミダゾールを0、10、20、40、60、100、150、200、300、400、500と順に溶出させ、どのフラクションで最も不純物との分離が可能か調べているところです。 その後、高濃度の塩やLiClをさらに加えて検討することにします。 GSt融合タンパク質を発現精製は、初めての経験でして、条件検討をいくつも重ねる必要があるのだなあと自分の浅はかさを知りました。 結果が出次第、シェアさせていただきます。ありがとうございます。 >[Re:5] おおさんは書きました : > >[Re:3] 火星の人さんは書きました : > 調べないで言っているので保証できませんが、塩濃度を上げるなどで外せるかもしれません。５００mMぐらいのNaClとか。または変性させるほど強い効果はないカオトロピック作用をもつもの。たとえばLiClとか（濃度的には１Mとか２Mとか、もちろんそれより低くても効果がある可能性もある）。

(無題) 削除/引用 No.6608-6 - 2018/01/23 (火) 06:28:33 - 火星の人 SYBR masterさん、 ありがとうございます。 それも最初考えたのですが、アフィニティクロマトグラフィー用のbaitを作りたかったので、GSTタグは残しておきたいんです。。 GSTタグがC末に来るようなベクターがあれば、N末にヒスを持たすなどの逆バージョンができるので、それでしたらいいのですが、、、。 >[Re:4] SYBR masterさんは書きました : > pGEX-6P系で発現させているのであれば、GSTの切り離しをグルタチオンビーズ中で行えば、GST単体はビーズから外れないので、ほぼ目的タンパク質のみに綺麗になりますよ。

(無題) 削除/引用 No.6608-5 - 2018/01/23 (火) 00:23:22 - おお >[Re:3] 火星の人さんは書きました : > > せっかく変性剤を使わずに可溶化できたので、機能的なアッセイに用いたいため、尿素やグアニジンはできたら使いたくないところです。。困りましたね。MBPタグに切り替えるなど抜本的な変更をする必要があるのでしょうか。。 > > 調べないで言っているので保証できませんが、塩濃度を上げるなどで外せるかもしれません。５００mMぐらいのNaClとか。または変性させるほど強い効果はないカオトロピック作用をもつもの。たとえばLiClとか（濃度的には１Mとか２Mとか、もちろんそれより低くても効果がある可能性もある）。

(無題) 削除/引用 No.6608-4 - 2018/01/22 (月) 15:07:41 - SYBR master pGEX-6P系で発現させているのであれば、GSTの切り離しをグルタチオンビーズ中で行えば、GST単体はビーズから外れないので、ほぼ目的タンパク質のみに綺麗になりますよ。

(無題) 削除/引用 No.6608-3 - 2018/01/22 (月) 13:38:16 - 火星の人 おお様、二量体を形成するとは過去のトピックで拝見しました。 なるほど。ですと、GSTで精製した後にも尚、切断されたGSTのものと、GSTー目的タンパク質ーヒスタグのものが二量体を形成しているということですね。なるほど、、、。 調べると分子間ジスルフィド結合ではなさそうですね？ ならばDTTやメルカプトエタノールは有効ではなさそうです。。 せっかく変性剤を使わずに可溶化できたので、機能的なアッセイに用いたいため、尿素やグアニジンはできたら使いたくないところです。。困りましたね。MBPタグに切り替えるなど抜本的な変更をする必要があるのでしょうか。。

(無題) 削除/引用 No.6608-2 - 2018/01/22 (月) 13:15:39 - おお GSTは２量体を形成するのでそれが外れるようなコンディションで精製するといいかもしれません。

Hisタグ付きタンパクの精製および濃縮について 削除/引用 No.6608-1 - 2018/01/22 (月) 10:50:46 - 火星の人 おはようございます。 大腸菌にて発現させたN末にGSTを付けたGST融合タンパク質を精製しようとしています。 リゾチーム、界面活性剤を工夫し、なんとか可溶性画分に抽出することができました。 この時点の抽出物は400mlあります。 ここから、グルタチオンビーズを加え、バッチ方法で3時間4度で転倒混和後、カラムに充填させ、25mM還元型グルタチオンで溶出を行い、モノを得ました。この時点で溶出物は5mlあります。 ただ理由はわかりませんが、GST融合タンパク質の他に、GST単独のものも精製されてきており（おそらく分解物）、これを除く目的でC末に6xヒスタグを持たせています。 そこで還元型グルタチオンで溶出した5mlの溶出物に、ニッケルビーズを加え、1時間、4度で反応させた後、カラムに充填させ、十分量の50mMトリス、150mM塩で洗った後、5mMイミダゾールを含む同バッファーで3CVほど洗浄したあと、500mMイミダゾールを含む同バッファーで溶出しました。 結果は、多少、非特異的なバンドは減っていますが、依然としてヒスタグを持たないはずのGST単体がしっかり残っており、正直、ニッケルビーズによる”精製”が行われたという印象を持ち得ませんでした。 そこでご相談なのですが、 1.　洗浄時に私は5mMイミダゾールを使用しましたが、もう少し高い濃度のイミダゾールを使うべきでしょうか？ 2.　溶出時にいきなり500mMイミダゾールを用いるのではなく、5、20、50，100，200，300，400，500mMなどと条件を振り、不要なものが含まず、目的のGST融合タンパク質が得られる濃度をまずは求めるのが先決でしたでしょうか？ 3.　6xヒスタグは目的タンパク質のC末すぐに負荷させましたが、グリシンセリンなどのリンカーを間に挟むべきでしたでしょうか？ 大変初歩的な質問でお恥ずかしい限りですが、周りに組替えタンパク質を作製しているものがおりませんので、ここを度々拝見させていただいております。どうぞよろしくお願いいたします。

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