全20件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.6618-20 - 2018/01/26 (金) 07:55:18 - AP いや、大腸菌が死に絶えていても、プラスミドを回収して再形質転換したら、リカバー出来る可能性があるってことでしょう。別にプラスミドとしてもストックがあれば、それで形質転換すれば手っ取り早くて確実ですが。

(無題) 削除/引用 No.6618-19 - 2018/01/25 (木) 21:59:28 - mori あおさん プラスミドを大腸菌から取る目的ではありません。 小スケールで発現の確認の為に、前培養として使っていました。 再度ミニプレップして、形質転換すると形質転換効率とかが悪くなるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6618-18 - 2018/01/25 (木) 05:48:42 - おお もしその大腸菌からプラスミドを取ることが目的で菌が生えないのなら、グリセロールストックの大腸菌を直接ミニプレップして、トランスフォーメーションし直して必要量のプラスミドを精製するのも手かもしれません。あまりいい方法ではないですけど。

(無題) 削除/引用 No.6618-17 - 2018/01/24 (水) 22:53:18 - mori APさん 色々ありがとうございます。 指摘して頂いたこと参考にして作製します。

(無題) 削除/引用 No.6618-16 - 2018/01/24 (水) 22:11:00 - AP overnight 一夜、です

(無題) 削除/引用 No.6618-15 - 2018/01/24 (水) 21:54:10 - mori 私の知識不足ですいません。 普通のo/n培養液のo/nの言葉の意味がわかりません。初歩的ですいません。

(無題) 削除/引用 No.6618-14 - 2018/01/24 (水) 20:09:08 - AP さらにちなみに、よほど特殊な事情がない限り、グリセロールストックにする培養液はログフェーズである必要はなく、普通のo/n培養液でいいです。OD600で言えば2-3とか。培養した細菌は種に使うだけですから、培養条件、培養状態は気にすることないのです。

(無題) 削除/引用 No.6618-13 - 2018/01/24 (水) 20:04:09 - AP ちなみに、グリセロールストックは融かさないように使います。 普通は、凍ったまを保ち（-30℃で予冷した保冷材入りチューブラックに入れるなど）表面を白金耳でひっかいて、そのまま寒天培地にストリーク、または場合によっては液体培地に接種します。凍ったままであるので凍結融解が繰り返されることはありません。

(無題) 削除/引用 No.6618-12 - 2018/01/24 (水) 18:51:58 - mori APさん ご丁寧にありがとうございます。 以前自分が参考文献通りにグリストを作製し、−20℃で保管していたら凍結してしまい、凍結融解の際に物理的に細胞に傷が入るからグリセロールの濃度を上げて保存しろと言われましたが、自分自身誤った認識をしておりました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6618-11 - 2018/01/24 (水) 18:16:48 - AP >内の研究室のドクターにグリセロールは不凍液やから、凍らせるのはまずいと言われましたが、 いやいや、凍らせないと意味ないでしょう。 凍結融解で酵素が変性するので、酵素などを-20〜30℃で保存するときに50%グリセロールにするのは凍らせないためです。 しかし、大腸菌の長期保存はDeep freezer (-80℃）あるいは液体窒素中で凍結した状態でないと意味ありません。グリセロールは水の結晶が大きくなって細胞を傷める凍害を防ぐためです。だって、培養細胞株だってカッチカチに凍結して保存しないとなんないでしょ。もちろん凍害を防ぐメディウムに交換してですが。 大腸菌のグリセロールストックの場合、流儀によって7.5-50%くらいの幅があります。Molecular Cloningは15%だったかな。グリセロール濃度が高いと短時間の温度上昇でも解けやすくなるので、私はむしろ低めの方が保存性がいいと感じています。10%かそれ以下。 >内の研究室のドクターにグリセロールは不凍液やから、凍らせるのはまずいと言われましたが、 なんか、あやしいドクター

(無題) 削除/引用 No.6618-10 - 2018/01/24 (水) 17:54:51 - mori APさん ご指摘ありがとうございます。 内の研究室のドクターにグリセロールは不凍液やから、凍らせるのはまずいと言われましたが、グリセロールは本来終濃度が10％〜50％になるように使用すればいいですか？

(無題) 削除/引用 No.6618-9 - 2018/01/24 (水) 17:51:43 - mori 20μg/mlでした。

(無題) 削除/引用 No.6618-8 - 2018/01/24 (水) 17:50:12 - mori カナマイシンの濃度は終濃度が20mg/μlになるように添加しています。

(無題) 削除/引用 No.6618-7 - 2018/01/24 (水) 17:41:39 - AP もー全く、意味も弁えずなんでもかんでも不用意に「発現」と言っちゃう人が多くてイカンよな。発現ってexpressionの訳語だぜ。 グリセロールストックは半永久的と言われてますが、死に絶えたり、タイターが下がったりということはよくありがちです。特にフリーザーのトラブルがあったりすると。 単にタイターが下がってるだけなら、多めに掻きとってストリークしたら生き残りの菌がコロニーを生じるかもしれません。 また、アクシデントで融けてしまってから再凍結していると、ほとんどの菌体が底のほうに沈殿していることがあります。シャーベット状になる程度まで融かして、爪楊枝や白金耳を底まで突っ込んで釣り上げると生えてくることもあります。 最後の手段として、グリセロールストック全体を液体培地にぶち込んで、しばらく培養して増えてきたところでストリークしてシングルコロニーを釣り上げるなんてことも、

(無題) 削除/引用 No.6618-6 - 2018/01/24 (水) 17:31:12 - み カナマイシン濃度は？ プラスミドサイズが15kb以上とかだと復活しにくいことはある。 抗生剤なしで数時間培養したあと、抗生剤加えてオーバーナイト培養してみたら。

(無題) 削除/引用 No.6618-5 - 2018/01/24 (水) 16:50:57 - mori 発現ではなくて、菌が生えないでした すいません。

(無題) 削除/引用 No.6618-4 - 2018/01/24 (水) 16:35:04 - AP 発現ってどういう意味で使ってるの？ 組換えタンパク質の発現ということ？　宿主っていっても組換えプラスミドが入ってるってことじゃない？ よくありがちなことで、過去トピにディスカッションがあったはずですよ。 起こし方はどうしてるんですか？ ストリークしてシングルコロニーから？それともグリセロールストックをスターターカルチャーとして直接投入？ グリセロールストックにすると発現しなくなることが多いので、大腸菌で組換えタンパク質をとるのを専門的にやってるラボでは、後者の方法をとってるようです。

(無題) 削除/引用 No.6618-3 - 2018/01/24 (水) 16:32:28 - み 画線培養してシングルコロニーをピックアップし直したら解決したことあるよ

(無題) 削除/引用 No.6618-2 - 2018/01/24 (水) 16:27:29 - 774R >発現しません。 kwsk

グリセロールストック 削除/引用 No.6618-1 - 2018/01/24 (水) 16:20:29 - mori 初歩的ですが、よろしくお願いします。 宿主株をOD＝0.6付近まで培養し、グリセロールストックに保存（半年前）していましたが、そのグリストを最近使用すると発現しません。 考えられることとして、グリセロールストックの劣化かLB培地の抗生物質の濃度が薄いとこ考えられますか？ 抗生物質はカナマイシンを使用しています。

全20件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---