いつも勉強させていただいております。
現在、GST融合タンパク質の発現、精製に取り組んでおり、リゾチーム処理で可溶性としてモノを得ました。
私どもの研究室は生化学をガッツリするようなラボではないため、上司がグルタチオンセファロースを買うことを躊躇い、代わりに上司のツテから100mlほどのグルタチオンセファロースを上司を介して手に入れました。
これを用いて精製を行なったところ、50％ほどしか結合せず、まだ大部分がフロースルー分画にGST融合タンパク質が出ていっています。調べたところ、2005年に使用期限が切れており、おそらくグルタチオンが酸化されてしまったがために、結合能が低下しているのでは？と疑われました。
新しいものを買うのも手ですが、後学として教えていただきたいのですが、この古くなったセファロースにDTTやメルカプトエタノールなどを加え、還元処理したのち、還元剤を洗い流すと結合能が増加することは期待できますでしょうか？
時間が空いた時に、自分で確認してみようとは思っていますが、もしそのようなことを試された方がいらっしゃいましたら、印象を聞かせていただけませんか？GEさんにも今お尋ねしているところです。また、GEのページにも、1mM DTTを結合バッファーや溶出バッファーに加えると、ビーズとモノの結合が増加することがある、ともかかれてあります。（ただ、私のモノはジスルフィド結合があるようなので、未使用のビーズを還元剤処理することしかできそうにありません。。）
ちなみに、フロースルー分画に来たモノが、実は壊れてしまっていて、グルタチオンセファロースに結合しなかったのでは？とも考えており、それに関しても、再度グルタチオンビーズと反応させることでどうなのかを検討しようと思っています。 |
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