monさん、的確なご指摘ありがとうございます。
レポーターアッセイだけでは十分でないと言う点は重々承知しております。
さて、ご指摘を参考に転写因子の変異体について調べてみたところ
実験に使うマウスの遺伝子で変異体は見つかりませんでしたが(ノックアウトはもちろんありました)、ヒトのホモログ遺伝子で複数の突然変異が報告されていました。
特にDNA結合ドメインでの点変異で結合能が完全もしくは弱くなり、報告によっては転写活性化能もほぼ完全に失われるものがありました(全ての培養細胞で同じかどうかは不明です)。
今回の転写因子は、マウスとヒトの間でアミノ酸配列が非常によく保存されていましたので、いくつか選んで変異を組み込んだコンストラクトを作成しようと思います。
そこで質問ですが、ネガコンの変異体にはどのようなものが相応しいのでしょうか。
例えば先にあげた点変異や、DNA結合ドメインをごっそり抜いたもの、またはフレームシフト変異や開始コドン変異などが考えられます。
また変異によってはドミネガ効果で予期せぬ影響もあるのではないかと危惧しました。
結果的にネガティブなデータが得られればそれで良いのかもしれませんが、変異体を用いたネガコンの通例というものがあれば教えて頂けると助かります。 |
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