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(無題) 削除/引用 No.6689-10 - 2018/02/16 (金) 08:08:12 - X ヒトB細胞ではやった事がないですが、EBVで不死化したマウスB細胞株への遺伝子導入をやっていた事があります。もう皆さんおっしゃってますが、MOIを上げる（濃縮）、spin infection、などはすぐにできる事かと思います。私の感染実験では、レンチではなくecotropicのレトロウイルスを用い、spin infectionでやってましたが、20-30%くらいは入ってました。 ちなみに、お使いのレンチウイルスのenvelopeは何を使ってますか？ pMD2.GなどVSVG-pseudotypedの場合、必ずしも万能ではなく、受容体と考えられているLDLRの発現が低い細胞（ヒトB細胞？）では難しいかもしれません。レンチウイルスベクターのpseudotypingについてのレビューを見つけたので、貼っておきます。ご参考まで。 http://online.liebertpub.com/doi/full/10.1089/hgtb.2017.084

(無題) 削除/引用 No.6689-9 - 2018/02/15 (木) 22:22:41 - MP > LCLがヘルシーに増殖するためには細胞密度がとても大事です。またオートクラインで分泌されるような成長因子なども増殖に大事だと言われています。 > MMCかX線処理したLCLをフィーダーに使えば増えてくるかもしれませんね。 もしレンチが第3世代なら第2世代にすればタイターはあがると思います。 濃縮はPEGより超遠心のほうが有効です。大量の培養上清を濃縮するのに一旦PEGである程度濃縮してさらに超遠心ということもやってました。 感染時に遠心させるにはプレートごと遠心させたほうがよかった印象です。プレート用のローターが必要ですけどね。

(無題) 削除/引用 No.6689-8 - 2018/02/15 (木) 10:35:52 - YK 774様、ありがとうございます。 実はフィルター滅菌を前のラボで行なっていたのですが、新しいラボではフィルターを持っていないため、5000gという高い遠心力で、極力コンタミした293Tを殺そうと思っています。 ウイルス濃縮用PEGを購入して行なってみたのですが、濃縮はワークしませんでした。 遠心しながら感染というのは血球細胞でよく聞きますね。 100mmディッシュだとどう行いましょうか。。あるいはT25フラスコでも遠心って難しいですよね？

(無題) 削除/引用 No.6689-7 - 2018/02/15 (木) 10:33:16 - YK MP様、ありがとうございます。 LCLがヘルシーに増殖するためには細胞密度がとても大事です。またオートクラインで分泌されるような成長因子なども増殖に大事だと言われています。 私もこれまでに何度か0.1％程度の感染細胞をセルソートしましたが、やはりソーティングに耐えられないといいますか、全くその後増えて来ず、死滅してしまいます。 なので、せめて10％ほど感染効率をあげて、その後、ソーティングできればと考えています。。。。 ジーンパルサーで導入後、薬剤で選択したこともありますが、事前に最低有効濃度の抗生物質を求めて、その濃度で処理したにも関わらず、何も増えてきませんでした。

(無題) 削除/引用 No.6689-6 - 2018/02/15 (木) 10:30:06 - YK おお様、 ありがとうございます。 白血球細胞でははいりにくいということが知られていたんですね。 私の経験ではLCLはどうもはいりにくいです。 JurkatやHL60ではそれぞれ50、10％ほどは感染しますので。 論文紹介いただきありがとうございます。 感染時に抗原刺激なしでも、改良版をつかうと大分感染するんですね。 アドジーンでベクターが買えないかみてみましたが、なさそうでした。。 どうにか手に入らないでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.6689-5 - 2018/02/15 (木) 09:45:06 - 774 293Tの培養上清を遠心5000gは強すぎはしないですか？ 以前、800gで遠心してフィルター通して使ってた記憶があります。 Jurkatで感染できてるようなので問題ではないかもしれませんが、 その際はご容赦を。

(無題) 削除/引用 No.6689-4 - 2018/02/15 (木) 09:40:07 - 774 LCLだからというわけではありませんが、簡単にできそうなものは １）ウイルス液を濃縮する ２）遠心しながら感染させる くらいですかね。

(無題) 削除/引用 No.6689-3 - 2018/02/15 (木) 09:35:54 - MP 0.1%でも選択すれば安定株が取れると思うのですが、それではダメなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6689-2 - 2018/02/15 (木) 09:24:23 - おお 白血球系の細胞はよくレンチでは入りにくいという話がここでも上がりますね。 詳しくはないんですが、 http://www.bloodjournal.org/content/116/3/498.long?sso-checked=true https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2951569/ Commercial availableであったりすればとっかかりやすいかもしれませんけど、、、実際にやっている人のコメントが付けばいいですね。

不死化ヒトB細胞（LCL）へのレンチウイルス感染 削除/引用 No.6689-1 - 2018/02/15 (木) 05:43:35 - LCLs 質問させてください。 ヒト末梢血Bリンパ球をEBウイルス感染により不死化させました。 以下、immortalized B cells or lymphoblastic cell line (LCL)とさせていただきます。 この細胞へGFPを発現するレンチウイルスを感染させたいのですが、0.1％ほどしか感染効率がありません。 ラボではルーチンにJurkatなどに感染させてますので、手技の問題ではなく、細胞の問題かと思います。 LCLへは一過性発現の場合、ジーンパルサーで行なっており、5割以上の導入効率が得られますが、今回ジーンパルサー後の薬剤セレクションではなく、なんとかレンチウイルスで発現させたいです。 みなさまの中でLCLへのlentivirus感染で工夫されておられるようなことはありますでしょうか？ 些細なことでも構いませんのでどうか宜しく御願い致します。 ウイルスは293Tにより作製し、遺伝子導入後の培養上清を5000gで遠心し、上清をウイルス液としまして、2.5マイクロg/mlほどのポリブレンを加えて、48時間感染させています。24時間後には新しい培地を加えています。

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