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RT-PCRでシングルバンド産物がqPCR融解曲線では複数ピーク 削除/引用 No.6708-5 - 2018/02/21 (水) 10:50:37 - ひつじ XYZ様、おお様、SYBR master様 ご指摘ありがとうございます。 アイソフォーム等の発現組織の違いにより、ターゲットと別型を両方増幅している可能性はありそうです。 また、単一の増幅産物でも2次構造によって融解曲線が変化するのですね。これを機会にダイレクトシーケンスで産物の配列確認もすべきとは思いますが、プライマー再設計になりそうです。 SYBR master様のおっしゃる発現数の多寡により可能性も十分に考えられます。

(無題) 削除/引用 No.6708-4 - 2018/02/20 (火) 23:11:48 - SYBR master 取りあえず、何らかの理由でdsDNAがあれば、融解曲線はおかしくなるので、 この現象は、SYBRでのreal-time qPCRの欠点ではあります。 以前、我々もSNP?とかも考えたんですが、Dual peak（山に肩ができるタイプとか）は、1本鎖になりかけたDNAが部分的に2次構造を取るときも融解曲線の山ができうるので、実際sequenceしても特段違う配列がでなかったこともありました。 また、組織によってできたりできなかったりするのは、増幅産物の多寡で起きていると判断しています。あと、target regionのsplicing siteのGT-AGルールが微妙なやつ(GTGT…………AGAGとか）もDual peakになりやすかったと記憶しています。 ですので、経験的には融解曲線分析が怪しいときは、sequenceしても原因がわからないことが多いので、原因探すより、さっさとprimer setを新しく設定し直す方が楽ですし、時間が無駄にならないですよ。

(無題) 削除/引用 No.6708-3 - 2018/02/20 (火) 17:46:11 - おお PAGEで流せば数ベースの違いも見れるけどね。ノンスペかアイソフォームとかかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.6708-2 - 2018/02/19 (月) 23:15:16 - xyz ターゲット遺伝子がヘテロでSNPが融解点に影響を与えているとか ターゲット遺伝子がマルチコピーで組織によって微妙に違う配列が発現しているとか考えられませんか？ PCR産物を酵素で切るかダイレクトシーケンスで確認してみてはどうでしょう。

RT-PCRでシングルバンド産物がqPCR融解曲線では複数ピーク 削除/引用 No.6708-1 - 2018/02/19 (月) 21:21:09 - ひつじ ロシュのライトサイクラーでSYBR法により、ｑPCRの増幅領域を含む遺伝子断片をクローニングしたプラスミド希釈液をスタンダードに用いて定量を行っているものです。 ターゲット遺伝子をｑPCRで使用予定のプライマー対（130ｂｐていど）で増幅するとシングルバンドの産物が得られますが、融解曲線分析では、プラスミドを鋳型にしたウェルにシングルで出ている産物と思われるピークの他に高温よりにも二つ目のピークがある結果となりました。 産物より高温よりのピークは、組織によって有るものと無いものがあり、組織特異的に発現する別の遺伝子を増幅していることを疑いましたが、先述のようにRT-PCRゲル電気泳動ではシングルバンドのため、解釈に困りました。ゲルの分解能よりも差が小さい同程度のサイズの別の遺伝子を増幅しているのでしょうか。 皆様、ご教示お願い致します。

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