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(無題) 削除/引用 No.6722-4 - 2018/02/25 (日) 13:37:21 - AP １段階目のPCRで十分標的配列が増えているならオーバーラップ配列が短くてもいいと思います。だって短くても標的外にアニールするような配列は排除できているはずだし、標的のコピー数が多いところなら多少効率が悪くても目的は達せられるはずだし。 15 ntくらいなら十分かな。10 ntうーんどうでしょう。5 ntだとPCR産物の内部にもありそうな。cDNA合成、プローブラベルなんかでランダムプライミングするときですら6merとか8merですから。しかも少なくとも反応開始時は25℃とかでやらないとプライミングできませんから。一旦熱変性した鋳型を使って、Klenowなんかを混ぜておいて、最初に低温で第二プライマーから伸長した産物を生じさせてからサーマルリサイクルしたらできるかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.6722-3 - 2018/02/25 (日) 10:22:08 - xyz monさん なるほど、アニールしやすさと分子の確率的な挙動で考えれば良いと。 そう言えばオリゴdTも15〜20merが多いですね、納得しました。 ふと思ったんですが、asymmetric PCRも濃度を非対称にするのではなくアニールする長さを非対称にすれば片側鎖が優先的に増えたりするんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6722-2 - 2018/02/25 (日) 08:56:00 - mon primerがアニールする部分のTmと酵素活性の兼ね合い、および特異性を考慮すると良いです。 Tmが低くても時間を長めにすれば確率的に伸長反応は生じるので、PCR途中で全長がアニールすると想定したPCR条件に変更すると、目的産物が得られるとは思います。 要は鋳型が多いときのPCR primerの長さと考えれば良いだけなので、15-17mer程度あれば、通常苦労なく増えます。大量に鋳型があれば12mer程度でも増えますが、アニール温度を30℃から徐々にあげていくなどの工夫が必要かも。 遺伝子合成などの目的で、意図的にプライマーダイマーを作る場合は(濃度が大きいので）10mer程度でもOKですが、成功率・PCR条件の修正余力を考えて15mer程度（3’端の配列により調整）にしています。

2段階PCRで重ねるプライマーの長さ 削除/引用 No.6722-1 - 2018/02/25 (日) 00:59:32 - xyz 2段階PCRを行う予定です。 2段階目のPCRでは、1段階目のPCR産物の両端に数塩基重なるプライマーを設計します。 この時、重ねるプライマーの塩基数はどの程度の長さが良いのでしょうか。 私自身の経験上、20塩基もあれば十分にPCR産物が得られるのは分かっていますが、ではこれをもっと短くした場合、例えば10塩基とか5塩基だとPCR産物は得られるのでしょうか。 当然、配列によって効率は変わると思われますが、一般的なものとして教えて頂けると助かります。

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