Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る | トピック一覧 | 研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム(readのみ)

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

PCRのサイクル数とクローニングエラー トピック削除
No.6725-TOPIC - 2018/02/27 (火) 11:47:40 - xyz
すごく初歩的な質問ですいません。
PCR産物をクローニングする場合、サイクル数は少ない方が良いですか?
それとも35サイクルとか十分に回しても、クローニングで拾えてくるコンストラクト上のエラー頻度は変わらないものでしょうか。

酵素自体のエラー頻度が一定だとするとサイクル数は関係ないと思いましたが、あまり自信がないです。。。
エラーが入ることで増幅効率が上がるかもとは思いましたが、そんな極端に変わるとも思えず。
 
- このトピックにメッセージを投稿する -



6件 ( 1 〜 6 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.6725-6 - 2018/02/27 (火) 12:43:53 - xyz
APさん
なるほど。反応の最初と最後では系のバランスが大きく異なるのですね。
昔、サイクル数は少ない方が良いと習ってその通りに実験していたのですが、
ふと考えてみると理屈を理解しておらず変な考えをしてしまいました。

具体的な説明をありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.6725-5 - 2018/02/27 (火) 12:32:08 - AP
>酵素自体のエラー頻度が一定だとするとサイクル数は関係ないと思いましたが、あまり自信がないです。。。

いや、基質のバランスが刻一刻と変わっていくので、その考えはあたりません。
dNTPが枯渇してくるとエラーレートがあがります。PCR産物が増えるに従って鋳型に対するdNTPの濃度は大きく変わります。
また、サイクル数が多いと酵素も劣化してくるので、意図せぬ副反応が起こるかもしれません。

例えばPCRベースでsite directed mutagenesisしようという場合など、鋳型を多め、サイクル数少なめ(例えば10回以下)で意図せぬ変異が入らないようにするのが普通です。増やすんじゃなくて変異配列を作るのが目的なので、サイクル数を多くするのは得策じゃないからです。

(無題) 解決済み 削除/引用
No.6725-4 - 2018/02/27 (火) 12:27:25 - xyz
例えば鋳型の長さ100bp、エラー頻度が0.01%だとして、鋳型が100コピーあります。

1回目のサイクルで倍に増えて200コピー中、エラーありが2コピー。
2回目のサイクルで400コピー中、エラーありが2+4=6コピー。
3回目のサイクルで800コピー中、6+8=14エラー。

ほんとですね。。。考えが足りませんでした。
素早いご指摘ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.6725-3 - 2018/02/27 (火) 12:14:35 - おお
電気泳動できれいにバンドが出るほど増やせばいいです。

エラーもサイクルごとにその頻度で起こるので、どんどん増えていきます。また、変な副産物もサイクル数を重ねて行くほど顕著になってくるでしょう。

(無題) 削除/引用
No.6725-2 - 2018/02/27 (火) 12:04:19 - mon
>酵素自体のエラー頻度が一定だとするとサイクル数は関係ないと思いました
増幅した合計鎖長を考えれば、関係あるのは明白です。
とは言え、最近の高正確性酵素を用いれば滅多に変異は入りません。
小心者なので数クローン(3クローンくらい)の塩基配列は念のため確認しますけど。

PCRのサイクル数とクローニングエラー 削除/引用
No.6725-1 - 2018/02/27 (火) 11:47:40 - xyz
すごく初歩的な質問ですいません。
PCR産物をクローニングする場合、サイクル数は少ない方が良いですか?
それとも35サイクルとか十分に回しても、クローニングで拾えてくるコンストラクト上のエラー頻度は変わらないものでしょうか。

酵素自体のエラー頻度が一定だとするとサイクル数は関係ないと思いましたが、あまり自信がないです。。。
エラーが入ることで増幅効率が上がるかもとは思いましたが、そんな極端に変わるとも思えず。

6件 ( 1 〜 6 )  前 | 次  1/ 1. /1


パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール   アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存(次回の入力の手間を省けます)
上に上げない(トピックの一覧で一番上に移動させません)
解決(問題が解決した際にチェックしてください)
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 

〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。