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(無題) 削除/引用 No.673-9 - 2012/07/03 (火) 02:26:06 - nn 白濁したものを遠心で除いた後、念のため、電気泳動でもして目的のタンパクが溶けているかどうか確認してもよいかもしれません。白濁したものの目的のタンパクは無事と言う可能性も少しはあると思います。 あとは、アミノ基以外での固定も考えられそうですね。

(無題) 削除/引用 No.673-8 - 2012/06/30 (土) 22:45:59 - (゜Д゜ buffer交換なら、透析でなくても脱塩カラムみたいなやつでできるよ。簡単だし、ごく短時間で終わるから、変性しやすい蛋白質には向いてるよ。

(無題) 削除/引用 No.673-7 - 2012/06/29 (金) 10:38:33 - nekeu 皆様ご回答ありがとうございます。 > 目的によっては、GSTは切断しなくてもいいのでは？？むしろGSTあったほうがGSTをネガコンにおいたりできるので便利だったりなんてことはないですか？ 文献に従いまして、固相化用のタンパク質はGSTを切断し、もう一方のタンパクをGST-fusionのまま用い、GST抗体で複合体形成を検出＆GSTをネガコンにおく予定でした。 > そのまますすめるならば、プレートに固定したあとにバッファ置換でいいんじゃないんでしょうか。 タンパク質アミノ基を用いてプレートに固定化しようと考えておりまして、切断時に用いるTris系のbufferでは固定化を行うことが出来ませんので、固定前にbuffer置換が必要でした。 皆様のおっしゃるとおり、凝集を防ぐことが難しいようであれば、切断せずに固定化しもう蛍光標識など別の方法で検出する方法がよさそうですね。プレートへの固定方法の検討も行ってみようと思います。 化合物の評価を行うため評価したいタンパク質間相互作用以外の要因はなるべく取り除きたく、可能ならばGSTはすべて切断して用いたいという思いはあるのですが… 初歩的な質問かもしれませんが、タンパク質の精製を行ううえで、こういった凝集の問題はよく起こることなのでしょうか？ また、GST-fusionタンパク質を固定化しGSTをネガコンとして用いる場合、どちらも固定化されるタンパク質量をそろえる必要があると思うのですが、例えばGST-fusionタンパク質とGSTをそれぞれ固定化し、蛍光標識GST抗体で検出したとして、蛍光量から固定化されたタンパク質量を単純に比較してよいものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.673-6 - 2012/06/29 (金) 02:29:38 - ne gdさんの方法だとanti-GST coatedとかglutathione coated plateとか市販のプレートが使えそうですね。

(無題) 削除/引用 No.673-5 - 2012/06/28 (木) 21:13:00 - ~ 目的がELISAの固相化用であれば、gdさんの書かれているように、GSTを付けたままで進めるほうが楽だとは思います。 （GSTのみのネガティブコントロールで反応してしまうサンプルが予想されたり、GSTとの結合部位に特異的に結合するなどがあれば困りますが） >PEGによる修飾はタンパク質間相互作用に影響しないものなのでしょうか？ おそらくは、タンパク質表面の疎水性部分をPEGがブロックすることにより、タンパク質同士の結合を防ぐのが凝集防止のメカニズムだと思います。 同種タンパク質同士の相互作用が阻害される以上は、異種タンパク質との相互作用に影響しないとはいえないでしょう。 ただ、タンパク質とPEGは共有結合はしないでしょうから、固相化後に洗浄で除けるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.673-4 - 2012/06/28 (木) 20:57:23 - gd 目的によっては、GSTは切断しなくてもいいのでは？？むしろGSTあったほうがGSTをネガコンにおいたりできるので便利だったりなんてことはないですか？GSTを利用してプレートに固定したりなんてことは出来ないんでしょうか？ そのまますすめるならば、プレートに固定したあとにバッファ置換でいいんじゃないんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.673-3 - 2012/06/28 (木) 19:19:21 - nekeu ~様　ご回答ありがとうございます。 参考にしている文献では、精製までは0.1 M KCl入りのHEG bufferを用いておりました。 タンパク質を精製した後、ELISA型のアッセイを用いてタンパク質相互作用を阻害する化合物の評価を行おうと考えており、同じ文献ではアッセイ時にはタンパク質のbufferにPBSを用いていました。 そのため置換方法は不明ですが、PBSでも問題はない、というよりもELISAのためにPBSが好ましいと考え透析によるbuffer置換を行ったところ凝集が見られた次第です。 まずご指摘いただいた通り、塩濃度を上げることを検討してみたいと思います。 プレートへの固定化を行う関係でアルギニン等アミノ基を含む化合物は避けねばなりません。 PEGによる修飾はタンパク質間相互作用に影響しないものなのでしょうか？ 普段化学屋なもので、こうした生化学的な手法に疎く、難儀しております。

(無題) 削除/引用 No.673-2 - 2012/06/28 (木) 17:07:38 - ~ そもそもそのタンパク質の疎水性が高く、PBSでは凝集してしまうのでは？ GST自体は親水性が高いので、融合タンパク質では溶解しているのかもしれません。 その場合、置換するバッファーにアルギニンを入れたり、塩濃度を高めたり、PEGなどの保護剤?を入れると溶ける場合があります。 まずは、目的タンパク質の性質について、文献情報等を調べてみてはいかがでしょうか。 過去に精製された報告があれば、バッファー条件が書かれているでしょう。

大腸菌を用いたタンパク質精製とバッファー置換について 削除/引用 No.673-1 - 2012/06/28 (木) 16:34:06 - nekeu いつも勉強させていただいております。 現在大腸菌を用いてあるタンパク質の精製を試みております。 pGEX-6Pベクターを用いてGST-fusionとして発現させ、バッチ法により回収しPreScission Proteaseによって切り出しました。 その後透析によりbufferをPBSに置換しているのですが、over nightでの透析後アグリゲーションというのでしょうか、白くもやもやとにごった状態になり、タンパク質が変性してしまっているようです。 GST-fusionのまま溶出させ透析した場合ではこのような現象は起こりませんでした。 原因として考えられること、解決法をご教授いただけないでしょうか。

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