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(無題) 削除/引用 No.6749-7 - 2018/03/12 (月) 00:32:56 - あかね このページのFig3を見てみたら。 http://sg.idtdna.com/pages/education/decoded/article/oligo-synthesis-why-idt-leads-the-oligo-industry オリゴ合成は100%完璧ではありません。オリゴの長さが長くなればなるほど、完全長のプロダクト割合が減ります。

(無題) 削除/引用 No.6749-5 - 2018/03/08 (木) 11:31:50 - toto もちろん合成でのミスはありえますが、実際にIDTから大量にオリゴは買ってNEBuilderでつないでプラスミド作ってますが、そのprimer内での変異と思われるものは記憶にありません（記憶力悪いですが）。もちろんshRNAの場合は別ですが。 たまに見られる想定外の変異はほぼPCRで延ばした中の配列でおきていて、これらはPCRというより、NEBuilderの反応過程で発生したのではと思っています。ligationでつなぐときでもBuilderやin-fusionにしても、作ったベクターはseqで確認する必要があり、偶発的な変異に備えて、２つのクローンを読むようにしています。

(無題) 削除/引用 No.6749-4 - 2018/03/08 (木) 10:48:01 - 中年 クローニングして配列を確認すると変異（塩基置換）があるオリゴがごくたまにあります。同じサービスを使っていてもロットによりけりという印象です。酷いときは文句を言って再合成してもらいますが、そうすると大丈夫なので大腸菌内での選択のせいでないことは確認しています。合成反応が不完全なのではなく、合成後の保護基の脱保護が不十分で、大腸菌の修復系のせいで変異が導入されているのではないかと個人的には思っています。

(無題) 削除/引用 No.6749-3 - 2018/03/08 (木) 10:33:02 - AP 何にしてもプラスミドにクローニングした段階で、個々のクローンについてシークエンスはするべきでしょう。 大部分の分子が正しく合成されていたとしても、たまたま拾ったそのクローンはエラーをもつ分子かもしれません。 ヌクレオチドの重合の精度は一段階ごとに100%ではありませんから、60回も繰り返せばかなり不正な産物ができます。 不正な産物の大部分はヌクレオチド欠失という形になるので（経験上、置換がないわけでもないが）、アクリルアミドゲルで電気泳動すると一から数ヌクレオチド短いのが見えるものです。 このような短い産物を除く精製オプション（アクリルアミドゲル切り出しなど、自前でも可能です）を付けていない場合は、特に危険。

(無題) 削除/引用 No.6749-2 - 2018/03/08 (木) 10:13:33 - おお 最近のオリゴの精度はわかりませんが、一塩基ずつついでいく際に未反応物があるとそのステップの塩基をスキップしてしまったオリゴができますのである一定量短いものができたりもします。その後精製でなるべくちゃんと合成されたものが回収できるようにするのですが、精製の方法でその純度も変わってきます。また、精製後にMassを測りどの程度うまく言っているか確認してから出荷する会社もあります。 このようにいろいろな要因であなたの注文したオリゴの正確さが変わってきます。６０って結構長いので変なのが混じっている可能性は普通注文するプライマーよりできは悪いかもしれません。また、ライゲーションのときのアクシデントで削れてたりとか変なクローンも出るかもしれません。とくにcPCRではインサートとベクターの長さを直接見たわけでないので変なものもポジで取れてくる可能性がありますし、プラスミドを精製して制限酵素などを使ったとしても６０マーを正確に検出することはまずできないので、２、３ベース削れていても変なクローンとして外すというのは厳しいし、下手するとタンデムにはいったり変なものが入ったりした１２０マーとも区別ができない。 私は未知数なところが結構あるので配列は読むでしょう。時間を節約するならそのオリゴを入れたあとに数クローンとってすぐに次の操作に移っている間にその数クローンの配列をよむなどするといいかもしれない。

注文したプライマー内の変異 削除/引用 No.6749-1 - 2018/03/08 (木) 09:36:06 - オアシス IDTから60塩基長ほどのオリゴを注文したんですが、それをプラスミドにライゲーション予定です。 やはりシークエンスはした方が良いでしょうか？ 私自身は経験ありませんが、プライマーの配列が注文通り出ない場合や、エラーが入る場合があると聞いたことがありまして、不安です。まあシークエンスすればいいのでしょうが、cPCRで入っていることが確認できれば、さらにそこへ3kbpほどの遺伝子をぶち込みたいと思っており、時間的な制約からIDTを信じようかと思っている自分もいまして。どうなんでしょうかねえ。

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