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(無題) 削除/引用 No.6764-4 - 2018/03/14 (水) 00:52:12 - 名無しさん neutrAvidin-beadsっていうのがある。普通のavidin-biotinみたいにガチで気合いの入った結合はせず、ほどほどのいい感じの強度でbiotinと結合するので、外しやすい。ので回収率もいいらしい。普通のavidin biotinの結合は半端ないのでSDSである程度は解離するだろうけど通常のaffinity purificationと比べたら回収率は高くないのではないかという印象をもっている。 あと、生理的な翻訳後修飾のひとつとしてprotein biotinylationというのがあるので(生化学よくしらないのであとは調べてください）、もともと細胞内にはbiotin化された蛋白質はあるから、そういうのとavidin-HRPがaffinity purificationでくっついてきて濃縮されて、で、westernでまたそれが検出されて上から下までバッーていうかんじでレーン全体にわたる強いシグナルが見えるたのではないかとおもう。

(無題) 削除/引用 No.6764-3 - 2018/03/13 (火) 10:04:27 - 困った人 みさん、 そうなんですね。ネイチャープロトコルにはSDSサンプルバッファーに2mMビオチン、20mM　DTTを加えて煮沸しているので、必要なんだろうか？と疑問に思いトピを立てさせていただきました。必要ないとのことで安心しました。ありがとうございます。 ＞EGFR抗体プルダウンサンプルをavidin-HRPでblotしたら、total lysateと比べてシグナルが濃縮されるのか？ 今再度行なっているところです。 初回では、トータルインプットではレーンが全体的に染まっておりインプットのうち、どれが該当するのかわかりませんでした。

(無題) 削除/引用 No.6764-2 - 2018/03/13 (火) 09:42:26 - み SDS sample buffer中で煮沸のみで問題ありません。 biotin labelingが上手くいっている保証は？ EGFR抗体プルダウンサンプルをavidin-HRPでblotしたら、total lysateと比べてシグナルが濃縮されるのか？

アビジンビーズでプルダウンしたサンプルがウエスタンで見えない 削除/引用 No.6764-1 - 2018/03/13 (火) 08:58:09 - 困った人 細胞表面をビオチン化しました。 EGFRに対する抗体で免疫沈降した際には、EGFRでウエスタンしたらバンドがでるんですが、ストレプトアビジンビーズでプルダウンしたものではEGFRのウエスタンが成功しませんでした。 ビーズからのタンパク質の溶出にはSDSサンプルバッファーを使ってますが、SDSと煮沸だけではビオチン、スオレプトアビジンの結合は切れないんでしょうか？つまり溶出バッファーにはフリーのビオチンを入れるばきですか？ 宜しくお願いします。

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