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(無題) 削除/引用 No.6772-14 - 2018/03/17 (土) 11:27:32 - mon >[Re:12] タンパクさんは書きました : > DNA fragment抽出後、１０％程度のサンプルを電気泳動。バンドが確認できれば、一般的には十分。吸光度はせいぜいが目安。 こんなこと当たり前だと思っていましたが。。kit信用しすぎは危険ですよ。

(無題) 削除/引用 No.6772-13 - 2018/03/17 (土) 09:37:01 - 苦労人 タンパクさん 抽出後のサンプルをまた電気泳動して確認するという確認法もあるのですね…気づきませんでした。コメント有難うございます。

(無題) 削除/引用 No.6772-12 - 2018/03/17 (土) 06:35:50 - タンパク DNA fragment抽出後、１０％程度のサンプルを電気泳動。バンドが確認できれば、一般的には十分。吸光度はせいぜいが目安。

(無題) 削除/引用 No.6772-11 - 2018/03/15 (木) 19:17:55 - 苦労人 APさん 理解しました。たくさんの情報を有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.6772-10 - 2018/03/15 (木) 18:53:40 - AP 安定性ではなくて定性的ってとこかな。 サイズがあっているか、別のサイズのDNAがコンタミしていないか、分解していないか、など情報は多い。

(無題) 削除/引用 No.6772-9 - 2018/03/15 (木) 17:55:43 - 苦労人 APさん ご指摘有難うございます。またまた大変勉強になりました。 確かに自分は、吸光度ばかりに目をとらわれるきらいがありました。 DNAラダーとの比較をするのも大切という事ですね！ 因みに、電気泳動で安定性をみるというのは、どのように見れば良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6772-8 - 2018/03/15 (木) 17:48:43 - AP >260/230があまりに低く、 OD230は多糖類の混入を示し、ゲル切り出しで他の要因（フェノールとか）は考えられないので、アガロースでしょう。気にしなくていいです。 収量だって次の実験に使えるのに十分なだけ取れてればいいんだから、そんなに気にしない。収量コンテストじゃないんだから。 アガロースが混入していてもダウンストリームの酵素反応がだめになることはありません。てか、ゲル切り出しでわざわざratioまで調べても意味ないと思うな。 純度の低かった昔の話と違って、いまのアガロースは純度が高いからin-gel反応したって酵素反応を阻害しないくらい。Ratioが重要であるとすれば、生物試料から核酸を精製したときのはなし。 あと、ナノドロップが普及してからなんでもかんでも吸光度測って済ませるという風潮があるけれど、吸光度は過信しないほうが良い。電気泳動でちゃんと定性的にも見たほうがいいし、モノとスタンダードのEtBrの染色強度の比色でDNA量をestimateするのも結構正確。吸光度のほうが不純物の干渉を受けやすいからね。

(無題) 削除/引用 No.6772-7 - 2018/03/15 (木) 17:45:45 - 苦労人 monさん 追加のご指摘を有難うございました。大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.6772-6 - 2018/03/15 (木) 17:32:21 - mon > （プラスミドの場合は、templateとは呼ばないのですか？） templateは「鋳型」です。 > およそ5割は回収できているのですね。 まずまずの回収率ではないでしょうか。8割くらいは欲しいところですが、元のplasmidの量の正確さやゲル外へ漏れている可能性、不十分なゲル溶解の可能性＋少なからずカラムを素通りするDNAがあるので、100%にはなりません。ゲル溶解液（結合液）や溶出液を多めにすると回収率が上がることもありますが。。 > ゲルが溶けきっていなかったという可能性があるのですね… そうではなく洗浄や遠心が不十分で、ゲル溶解液成分や洗浄液成分が目的DNA溶液に混入している可能性です。

(無題) 削除/引用 No.6772-5 - 2018/03/15 (木) 17:30:45 - 苦労人 monさん ご指摘を有難うございました。よく理解できました！

(無題) 削除/引用 No.6772-3 - 2018/03/15 (木) 17:21:31 - 苦労人 monさん 早速の回答を有難うございます。確かに文字化けしています…すみません 1ugのプラスミドを切断して、31ng/uLx10uL=310ngを回収しました。 （プラスミドの場合は、templateとは呼ばないのですか？） 目的断片の長さ(8Kbp)は、もとのプラスミド(12Kbp)の2/3です。とすると100%回収した場合、660ngなのですね…およそ5割は回収できているのですね。 濃度・吸光度測定時のblunkは、使用した溶出bufferを使いました。 ゲルが溶けきっていなかったという可能性があるのですね… キットのマニュアルを確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.6772-2 - 2018/03/15 (木) 17:07:10 - mon 文字化けで間違っているかもしれませんので、確認です。 1ugのPCR産物を切断して、31ng/uLx10uL=310ng回収出来たのですね。 目的断片の長さはPCR産物の長さのどれくらいの割合ですか？ 1/3なら回収率100%で333ngですよ。 またODを測定するときにblunkはキット付属の溶出buffer（目的断片の溶媒）を使っていますか？ キットのマニュアルに、260/230が低いときのトラブルシューティングが記載されていませんか？ゲル溶解液や洗浄液が残っているとその後の反応が阻害される可能性があります。

プラスミドの制限酵素処理 削除/引用 No.6772-1 - 2018/03/15 (木) 16:50:42 - 苦労人 クローニングの初心者です。 本日あるPCR産物を、Xho1(double cut)とAsc1(single cut)で処理したプラスミドベクターにクローニングする実験をしました。合計3箇所での切断ですが、それぞれの場所が1.5Kbp以上離れていたので、1µgのtemplateと2種の制限酵素を同時に入れて37℃1時間処理しました。直後に電気泳動して目的のバンドが3本あることを確認しました。gelを切り出して専用キットで精製し、最終的に10µlのelution bufferで抽出したところ、濃度が31ng/µl、吸光度が260/280=1.9、260/230=0.25という結果でした。 �@260/230があまりに低く、「糖質・塩類・有機溶媒の混入が考えられる」らしいのですが、原因としてはどのような事が考えられるのですか？ �A濃度も低いように思うのですが、これは許容範囲なのでしょうか？ �Bこの濃度・吸光度の結果で実験を進めても良いものでしょうか？

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