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(無題) 削除/引用 No.6775-21 - 2018/03/20 (火) 23:42:51 - りんご APさん HindIIIの方、きれいでびっくりしました。 おかげさまで問題を克服できそうな気がしてきました。 まずはプライマーの再注文から始めたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6775-20 - 2018/03/20 (火) 16:32:50 - AP PCR産物だと何故かなかなかそうはいかないんですが、普通のligation反応をしたあと電気泳動したら、もとのサイズのDNAのバンドなんかほぼ見えなくなりますよ。 こんなもんさ http://catalog.takara-bio.co.jp/com/tech_info_detail.php?mode=2&masterid=M100002688&unitid=U100003489

(無題) 削除/引用 No.6775-19 - 2018/03/20 (火) 16:24:17 - りんご APさん ありがとうございます。 インサート1倍長よりむしろ2倍長のバンドの方が濃かったので、片方（XhoI？）はある程度切れている気がします。インサートのみのライゲーションを流したのは始めてなのですが、よく切れている場合には、1倍長はほとんど見えない？、3倍長以上もラダー状に出てくるものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6775-18 - 2018/03/20 (火) 14:54:39 - AP >インサートの2倍の長さのバンドはしっかりと見えましたが、 monomerのまま残っている割合がどれくらいあるかも問題。

(無題) 削除/引用 No.6775-17 - 2018/03/20 (火) 14:35:26 - AP 片方しか切れていないってことですね。 NEBのデータでは末端の切断効率は Xho1は+1~3ntで20~50%、+4nt以上で50~100% Not1は+5ntまで20~50% Fermentasのデータではどちらも+2nt以上で50~100% Not1があやしいかな

(無題) 削除/引用 No.6775-16 - 2018/03/20 (火) 12:11:24 - りんご 他の実験でバタバタしていてなかなか進められていないのですが、インサートのみをライゲーションして電気泳動したところ、インサートの2倍の長さのバンドはしっかりと見えましたが、3倍以上の長さのバンド、スメアは少なくとも明らかなものは見えませんでした。やはりインサートがちゃんと切れていないのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6775-15 - 2018/03/20 (火) 07:38:11 - りんご pcrさん ありがとうございます。 私も、ギブソンアッセンブリーやInfusionを数回だけやったことがあるのですが、うまくいく時は一発でうまく行くものの、普通の制限酵素によるクローニングと同じ様に何回か失敗を繰り返したこともあります。 ストラテジーを変える、という点ではこれらの方法も十分選択肢にはあがるとは思うのですが、実際の難易度は、制限酵素によるクローニングとギブソンアッセンブリーと、どちらが簡単、確率が高いのでしょうか？ 今回は制限酵素が普通に使えそうだったので、制限酵素を用いるクローニングを選択したという程度で、とくにこだわりがあったわけではないのですが、こういう組換え方式のクローニングもメーカーのパンフレットが言うほど100%というわけではない気がしたりします。 明らかにギブソンの方が簡単なのであれば、状況を見てストラテジーを変えたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6775-14 - 2018/03/20 (火) 01:49:35 - pcr 制限酵素処理ではなく、ギブソンアセンブリーなどの相同組み換えで入れてみるのはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6775-13 - 2018/03/20 (火) 00:47:33 - りんご ~さん ありがとうございます。 インサートなし、ベクターのみのライゲーションサンプルからもコロニーがそこそこ増えてきます。 （かなり多いというわけではないですが、過去の経験上、もう少し少なくあってほしいと思う程度で、残念ながらインサートありとコロニー数に大差ありません） ベクターの切れも若干悪いとは思っているのですが、ベクターのゲル泳動の際、無処理のものとは明らかに泳動パターンが変わっていたので、ある程度は切れていると信じて、おそらくインサートの処理も悪いのではないかと思っています。 単純に片方の制限酵素の活性が落ちているだけ、というオチもあるかもしれませんが、~さんに指摘していただいたことを含めて、もう少し状況を整理して、次のステップに進んでみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6775-12 - 2018/03/19 (月) 18:17:57 - ~ インサートなしでベクターのみをライゲーションしたら、 コロニーはどのくらい出るのでしょうか。 それと、インサートありのコロニー数で差がないようなら、 当たりのコロニーを拾う確率は少なくなると思います。 ・インサートで切り出す分についてはUVは全くあてない ・インサートなしをコントロールに置く ・おまじない程度のつもりで、培養温度を30℃にする ・インサート有無でコロニー数が変わらないようで、力技で済ませるなら、 　コロニーPCRを片っ端から行う ・その時に、ついでに数クローンだけはインサート部分を読んで、 　親ベクターなのか何かごみの配列が入っているのかを確認する あたりを行うと、どういう状況なのかが見えてくると思います。

(無題) 削除/引用 No.6775-11 - 2018/03/19 (月) 15:44:03 - りんご APさん 早速ありがとうございます。 PCR産物の末端はそれほどまでに切れにくいのですね。ligase処理での重合を是非確認してみたいと思います。 ゼロに何を掛けてもゼロ、というのは本当に耳が痛いです。今回は、当たりが1個でも取れれば良い実験なので、数打ちゃあたると思って2回目の実験を行っていたのですが、無駄でした。 PCR産物を泳動する時、もったいなくていつも全量を同レーンに流してUV照射後に切り出していたのですが、これで当たりがゼロになる可能性があるぐらいなら、一部を場所確認用に他レーンに流して、残りだけをUVをあてずに切り出す方が、結局は良いのでしょうね。 皆さんの御指摘で、落とし穴になっていそうな部分がよく理解できた気がします。いま少しトラブルシューティングを行った上で再トライしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6775-10 - 2018/03/19 (月) 15:09:00 - AP プライマーにデザインしたPCR産物末端の制限酵素サイトは思う以上に切れにくいです。必要とされる長さの足場をつけても、まあ普通の効率では切れない。プラスミドなんかが100%切れる条件でも10%も切れていないんじゃないかしら。それは、制限酵素処理済みのPCR産物の一部をligaseで処理してみると検証できます。 ligase処理なしと比べて、ligase処理で重合産物がどの程度出来てるかを見ればいいです。ぜひ、試してみて検証してみてください。 この切れにくさは、ひょっとすると合成会社やグレードなんかによるのかもしれません（うちはいつも一番安いコース）が、対応策として、 1. 足場としての余剰のヌクレオチドを長くする（6 ntとか） 2. 制限酵素処理を過剰にする（酵素量を増やす、時間を延長する）。 をしています。 むしろ、末端制限酵素消化しないで末端リン酸化の上blunt-end ligationしたほうが成功しやすかったりして、いったんこれでクローニングしてから制限酵素消化断片を取るなんてこともやりました。 プラスミド：インサート比はあまり振っても意味ないです。組換え体出現効率を上げるには最適化しないといけないですが、一個でもあたりが取れれば良い実験なら、当たりが10クローンだろうと100クローンだと関係ないですから、無駄な手間です。一方、当たりが一個も出ないなら、効率を上げることに意味はないです。ゼロに何を掛けてもゼロですから。 インサートが長くなるとクローニングできにくくなるのは、みなさんが指摘されている原因にくわえて、長くなった分だけUV照射の影響を受けやすくなるということもあります。一分子のDNA断片のどこか一ヶ所にでもチミンダイマーができると複製が出来なくてプラスミドが機能しないわけですが、長ければ長いほどマトが大きくなるのでその確率は上がります。短いDNA断片の切りだして大丈夫な照射量でも長いDNA断片にはキツイということはあり得ます。

(無題) 削除/引用 No.6775-9 - 2018/03/19 (月) 14:40:43 - りんご APさん すみません。プラスミド・インサートの大きさを念頭において質問をしていたので、細かいマテメソを省略してしまいました。 親ベクターは、他のラボより入手したsleeping beautyのトランスポゾンプラスミドで、XhoI・NotI（切断部位の間の距離は9bp）で制限酵素処理したものを、ゲル抽出しました。 インサートは、XhoI・NotIサイトを付加したプライマー（制限酵素サイトの外には、足場としてそれぞれ3塩基追加）を用いてPCRで増幅し、エタ沈後制限酵素処理（2時間ぐらい）の後ゲル抽出しています。 ゲル抽出の場合はUV照射を数秒程度してしまっていますが、バンド確認とその周囲に一瞬切れ込みを入れるだけの時間にとどめ、長くても5秒以内だとは思います。（それでもAPさんにはUVを当てるな、と怒られそうですが。すみません。） 結局、親ベクターは3.7kb、インサートは3.1kbの長さになり、これをNanodropの濃度を元に親：インサート＝1:約10程度のモル比で混合しライゲーション（室温十数分）、自作のDH5aにトランスフォーメーションしたところ、37度O/Nの後、プレート上には当初15個程度のコロニーができました。これはインサートなしのコントロールとほぼ同程度の数で、結局、サンプルの8コロニーをつついてミニプレップ・XhoI/NotIでインサートチェックしましたが、全て外れでした（おそらく切れていない親ベクター）。 2回目の実験では、上記で一度切っていた親ベクターをもう一度XhoI・NotI＋CIAP30分追加で切りなおしたもの、また親ベクターを一から切ったものをもう一度準備し、それぞれゲル抽出し準備しなおしました。インサートは1回目の実験の残りをそのまま流用したのですが、今度は親ベクターの濃度、インサートの濃度をQubitで測定しある程度正確な値を出した上で、親：インサート＝1:1, 3, 7のモル比で混合しライゲーション（16度1.5時間）、自作DH5aにトランスフォーメーションしました。コロニー数はいずれのプレートにおいても1回目の実験とほぼ同等の印象で（1:1、1:3のプレートがややコロニーが多い気もしましたが正確に数えたわけではありません）、それぞれのプレートより4個ずつ、合計24個のコロニーをミニプレップしましたが、やはり全て外れでした。（形質転換効率はアバウトな計算しかできませんが、3-5コロニー/ベクター1ngぐらいかと思います） その後インサートがうまく切れていない可能性を考えたのですが、インサートを切りなおすだけではうまくいくか自信がなく、そもそも今回のプラスミド構築がどれぐらいの難易度のものなのか疑問に思ったとともに、インサートを切りなおす際にインサートの真ん中ぐらいで切ってインサートを2断片化すればインサートの一端は少なくとも切れていることが確認できるとともに、インサートが小さくなることによる効果もあるのかもしれない、と思い、最初の質問をさせていただいた次第です。 このような状態の場合、APさんでしたら次にどのようにされますでしょうか？ご教授のほど、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.6775-8 - 2018/03/19 (月) 10:15:42 - AP あと結果の詳細。あたりのコロニーが得られませんでしたというだけじゃ何が起こったのかよくわからない。コロニーは生えたがハズレばかりだったのか、コロニーが生えなかったのか。ベクターあたりのコロニー数はどれくらいだったのか。

(無題) 削除/引用 No.6775-7 - 2018/03/19 (月) 10:02:36 - AP どういう手順でやったのかの記載が全く無いので論議のしようがないじゃないですか。どういう手法で、どういう対策をしてうまくいかなかったのか、それをいってくれないと、助言をしても無駄になりかねない。 3 kb程度の普通のプラスミドベクターなら20 kbくらいまで入ります。

(無題) 削除/引用 No.6775-6 - 2018/03/19 (月) 07:31:24 - りんご おおさん ありがとうございます。大腸菌株の特徴については、これまで限られた知識しかなかったので、これを機会に勉強してみたいと思います。 また、コピー数を下げる工夫も並行して行ってみます。 ちょっとした壁にあたった時に、経験や知識の差が効いてくるのでしょうね。これからも精進して頑張ります。

(無題) 削除/引用 No.6775-5 - 2018/03/18 (日) 16:19:05 - おお >これは私の知識不足なのですが、PCRプロダクトはDNAメチル化がないなどの理由で大腸菌内でアタックされやすい ま、そういうことですね。なるべくそういう性質を軽減している大腸菌株もあるので（結構メジャーなもの）この機会にそれぞれの大腸菌株の性質をチェックしてみるといいかと思います。 >実は仰るように、入れたい遺伝子自体も大腸菌に悪さをしている可能性があります。 これに現実味があるなら、プレートの抗生物質濃度を下げるとか、プレートのインキュベーションを室温から３０度ぐらいでやるとかして、大腸菌内のプラスミドコピー数を下げた状態で増殖させるととれやすくなることもあります。

(無題) 削除/引用 No.6775-4 - 2018/03/18 (日) 13:11:12 - りんご タンパクさん ありがとうございます。 17kbと比べると私の場合は全く大したことがない大きさですね。もう一度同じ実験をして失敗を繰り返すぐらいなら、サブクローニングベクターを1回介して確実に前進した方が気持ち的にもいい気がしてきました。 リガーゼはやや古いものの、年度末なのでリガーゼ新調は難しいと思いますが、今後はリガーゼについて気にしておきたいと思います。 おおさん ありがとうございます。 > 使っているのがPCRプロダクトなので確かに大腸菌内でアタックを受けやすいかもしれません。そういう意味では半分ずつ入れていくというのはやってもいいかと思います。または大腸菌の株を変えるか。 これは私の知識不足なのですが、PCRプロダクトはDNAメチル化がないなどの理由で大腸菌内でアタックされやすいということでしょうか？また、半分ずつ入れていくのもありうる、というところは、プラスミド内の異物DNA成分？の長さが短めになるために少しは状況が改善するかもしれない、という意味でしょうか？ > インサートが長くなればなるほど、大腸菌のコンピテンシーが重要になってきます。そこも確認して見る必要があるかもしれません。 今の大腸菌は、しばらく前に作った自作のコンピテントで、これまでのクローニングには問題なく使えているのですが、若干コンピテンシーが悪い、増殖もやや遅い？印象があります。他の菌を是非試したいと思います。 > また入れたいフラグメントが大腸菌に悪さしている可能性もあるかもしれませんが、上記のような試行錯誤でなんとか回避されることはまあまああります。 実は仰るように、入れたい遺伝子自体も大腸菌に悪さをしている可能性があります。というのも以前、別のプラスミド構築の際に、今回の遺伝子や他の遺伝子を組み込んだプラスミドを並行して作っていたのですが、今回の遺伝子のコンストラクトのみ作成に難渋し、またマキシプレップで得られる収量も他の遺伝子のコンストラクトより少なかったです。 総合して考えると、いくつかの微妙な悪条件が合わさって、全体として成功率が悪くなってしまっている気がしてきました。 サブクローニングベクターを介しつつ、一つずつ問題をクリアしていきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6775-3 - 2018/03/18 (日) 10:02:26 - おお プラスミドの方の大きさはあまり関係ないでしょう。インサートがおおきいと難しくなりますが、世の中２０kbとか入れている人もいますので、その長さで非常に難しいとまでは言えません。 使っているのがPCRプロダクトなので確かに大腸菌内でアタックを受けやすいかもしれません。そういう意味では半分ずつ入れていくというのはやってもいいかと思います。または大腸菌の株を変えるか。 インサートが長くなればなるほど、大腸菌のコンピテンシーが重要になってきます。そこも確認して見る必要があるかもしれません。 PCRフラグメントは大腸菌内であったくをうける可能性も考慮に入れると、タンパクさんがしてきしているように、クローニング専用ベクターに一度入れるてもありです（そういうベクターはクローニングに特化されていて入りやすい用になっているので）。 また入れたいフラグメントが大腸菌に悪さしている可能性もあるかもしれませんが、上記のような試行錯誤でなんとか回避されることはまあまああります。

(無題) 削除/引用 No.6775-2 - 2018/03/18 (日) 06:25:56 - タンパク ”初心者レベル”とはいえませんが、普通に可能です。 私的には１７kbインサートを入れたことあります。 お話では、コロニーの数が少なすぎます。 「遠回り作戦」を勧めます。PCR産物を　pBluescriptなどのサブクローニングベクターへ入れ、ミニプレップ。増やしてものを、酵素で切り出して、再度ライゲーション。PCR産物は入りにくいです。 最終ベクターがペニシリン耐性であれば、サブクローニングベクターはカナマイシン耐性を使うと、バッククラウンドコロニーを減らせます。 インサートの量等検討するより、新品のリガーゼを使うのが、経験上、良いと思います。リガーゼはダメになりやすい。

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