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(無題) 削除/引用 No.6796-10 - 2018/03/30 (金) 05:31:14 - M2 みちる様、みなさま、 サーモフィッシャーさんから以下のようなコメントをいただきました。 一つのDH10Bacには1コピーのバクミドしか含まれておらず、ホワイトコロニーであること、目的のタンパク質が産生されていることから、私のコロニーは純粋なコロニーである、ようなことが書かれてあります。 ただ、何度もリストリークするような提案はいただきましたが。取り急ぎ参考までに。 Good to hear you can see the expected band on Western. This for sure confirms the right bacmid was made. However, it is hard to explain why you only get 300bp PCR product. We tend to think one bacteria cell can only takes one kind of bacmid.This is the basic for cloning, isn't it? If a bacterium can contain both empty vector and ligated plasmid, we won't be able to select the right colonies. This idea should also be applicable to bacmid. Although of course, we don't have any detailed research done on this topic. Even if one bacterium can contain both bacmids, since the un-transposed bacmid has intact LacZ gene, it should add some Blue color to the cololy. so I don't think this hypothesis can explain everything here. Usually when we have ambiguious results like this, we recommend to restreak the colonies, because we think this problem is caused by a mixed population of bacteria, not a single colony. And usually in such cases, after restreak, some blue colonies will show up on the plate. And we will restreak the while colonies again till on a plate we only get white clonies.

(無題) 削除/引用 No.6796-9 - 2018/03/30 (金) 00:48:50 - M2 みちる様、 IPTGとXGalは添加しています。 IPTGは他の実験で使っており、ファンクショナルであるはずです。 XGalも粉から調製していますし、青コロニーも極たまにでるので、大丈夫かと。。 LBアガーも十分冷めてから抗生剤、と上記2剤を加えています。 > わたしなら、形質転換からやり直ししてクローンを取り直しします。 実は形質転換は何度もやり直ししてるんです。。 同じ結果で参っています。 一つまた質問してもよろしいでしょうか？ DH10Bacは隣のラボからいただいたもの（そのラボで増やして自作したものみたいでした。）を、私のラボでも同様に増やして私が自作したものを使用しています。こういうのが原因になりえますか？新しく市販品を買うべきでしょうか？10年前に私がバキュロ発現系をやっていた時には、そのラボでは毎回大腸菌を購入していました。 6時間ですか、一度やってみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6796-8 - 2018/03/29 (木) 22:51:50 - M2 ありがとうございます。 たしかにPCR産物のダイレクトPCRはすべきですね。やってみます、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6796-7 - 2018/03/29 (木) 15:10:13 - みちる 回答見ましたが、まさかとは思いますが、 IPTGとXGalは添加してますよね？ 16個とって混ざったクローンしかないのなら、 わたしなら、形質転換からやり直ししてクローンを取り直しします。 形質転換後は4時間振盪培養となってますが、 6時間くらいのゆっくりした振盪培養してます

(無題) 削除/引用 No.6796-6 - 2018/03/29 (木) 14:33:00 - xyz >DH10Bacで白コロニーを得、そこからミニカルチャー、ミニプレップしたものにはバクミドが含まれますが、その抽出物にはpFastBac plasmidも含まれますよね？そうなるとインサート内に設計したプライマーでDNAシークエンスすると、配列がバクミド由来のものなのか、pFastBac由来のものなのかわからないのではないか？と疑問を持ちました。やはりこのストラテジー（つなぎ目を読む）は無理がありますよね？ 抽出したBacmidにpFastBacがコンタミしているというのであれば、あなたの言う「インサートの3’側に設計したフォワードプライマーと、Bacmid上のM13リバースプライマーでcPCRした」のPCR産物をダイレクトシークエンシングすれば、Bacmid由来の配列を特異的に読むことができますよね？ その配列からつなぎ目を決定することができると思います。

(無題) 削除/引用 No.6796-5 - 2018/03/29 (木) 11:29:39 - M2 みちる様、 はい、青白セレクションには48時間以上かけています。60時間かけたといっても過言ではありません。 いつになっても青が出てこないので非常に気持ちが悪く感じました。 > あと、コピー数は少ないけど1ではないので、組み変わってないものが残ってると、 > 質問者さんのは、おそらく、組み変わったものと、組み変わってないものが混ざってる状態です。 > そのバクミドクローンはタンパク発現が少なくなるので使わないほうがいいです。 ご指摘いただいたことは思いも浮かばなかったことで、とてもためになります。ありがとうございます。 コロニーPCRでは、ピックした16全ての白コロニー（といっても99.99％白だったのですが）でM13のFとRプライマーで300bpのバンドが出ています。 そのうちの一つのクローンをミニカルチャーして、バクミドを得ましたが、そのバクミドは組替えが起こったものとそうでないオリジナルのものが含まれているということでしょうか。。それは困りました。。うーん、どうしたらいいのか。。 みちる様はこの場合、16といわず、100-200とコロニーPCRを行い、M13のFとRプライマーで300bpを出さないクローンを探す、という選択を取られますか？それとも組替え効率を高める方法や抗生剤をよりたくさん与えるなどの方法を取るべきなのでしょうか？ 形質転換後、4時間、2mlのLB培地（SOC推奨ですが、SOC培地がなかったです。。。）でプレカルチャーしたものを3種の抗生剤の入ったフレッシュなLBプレートにまき、48-60時間、37度で培養しています。

(無題) 削除/引用 No.6796-4 - 2018/03/29 (木) 11:21:06 - M2 おお様、 ありがとうございます。 なんのといいますか、ノイズでした。 確かにバクミドの配列は公開されてはいないと思いますが、説明書にはM13のFとRプライマーで増幅されるのは300bpとあるので、そのどこかにトランスポジションすると考えています。

(無題) 削除/引用 No.6796-3 - 2018/03/29 (木) 09:19:24 - みちる バクミドの青白選択は時間がかかりますが、時間かけましたか？ 通常のプラスミドのつもり、一晩ではコロニーはあっても、青にはなりません。 夕方まいて、次の日の夕方に色判定してます。 あと、コピー数は少ないけど1ではないので、組み変わってないものが残ってると、 青になりにくく、M13F,M13Rで500以下の増幅が出てきます。 質問者さんのは、おそらく、組み変わったものと、組み変わってないものが混ざってる状態です。 そのバクミドクローンはタンパク発現が少なくなるので使わないほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.6796-2 - 2018/03/29 (木) 02:06:39 - おお >残念ながらM13のフォワードとリバースプライマーでは配列が読めませんでした。 なんの配列も検出されなかったってこと？ M13とか位置関係がはっきりしないけどマップとかある？

Bacmid抽出物にpFastBac plasmidもco-purifyされるでしょうか？ 削除/引用 No.6796-1 - 2018/03/28 (水) 12:04:32 - M2 いつも勉強させていただいております。 DH10Bacに形質転換を行なったところ99.99％白コロニーでした。 インサート長は3kbありまして、transpositionしたBacmidを製品説明書で推奨されるM13のフォワード、リバースのプライマーでPCRをすると理論的には5.3kb出るようですが、そのようなバンドはcPCRでは得られず、むしろインサートが無いことを示唆する300bpのみがでました。 ただこの解釈としては、コロニー以外にもプレート上に無数に巻かれた形質転換しなかったDH10Bacの死菌をPCRしている可能性もあると考え、ダメ元で、インサートの3’側に設計したフォワードプライマーと、Bacmid上のM13リバースプライマーでcPCRしたところ、期待通りといいますか、transpositionしたBacmidから予想される1200bpのバンドが出ました。形質転換しなかったDH10Bacからは1200bpのバンドは出ていません（ただ予想通り上記の300bpのバンドは出ています） ただ、やはり本当に欲しいバクミドが得られたかどうか確証が持てないので、DNAシークエンスをしようと思っています。残念ながらM13のフォワードとリバースプライマーでは配列が読めませんでした。そこで、インサートの3’側に設計したフォワードプライマーで3’がバクミドのバックボーンにつながっているかどうか読んでみようと想っています。 ですがここで疑問が浮かびました。 DH10Bacで白コロニーを得、そこからミニカルチャー、ミニプレップしたものにはバクミドが含まれますが、その抽出物にはpFastBac plasmidも含まれますよね？そうなるとインサート内に設計したプライマーでDNAシークエンスすると、配列がバクミド由来のものなのか、pFastBac由来のものなのかわからないのではないか？と疑問を持ちました。やはりこのストラテジー（つなぎ目を読む）は無理がありますよね？ DH10Bacに形質転換して99.99％が白コロニーというのも非常に気持ちが悪いです。。もっと青コロニーもできると予想していましたので。だいたいLBプレート上に50個ほどコロニーが出るように撒いています。 とてもわかりづらい文章になっているかと思います。すみません。 もしコメントいただける方いらっしゃいましたら、ご教示いただけますと幸いです。

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