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タモキシフェン誘導性Creについてお教え下さい トピック削除
No.680-TOPIC - 2012/06/30 (土) 09:34:05 - ねこ
fl/fl CreERT2マウスから分離したマクロファージをタモキシフェンを混ぜた培地で培養し、タモキシフェン開始1−4日後にライセートを回収し、目的遺伝子が除去されたかどうかをウェスタンブロットで確認しています。しかし、タモキシフェン開始後1−4日の範囲では、目的遺伝子のタンパクは全く変化がありませんでした。以下の点についてお教え頂きたく投稿させて頂きました。1.今回、タモキシフェン濃度は1uMで培養しましたが、どれくらいの濃度で皆様はご検討されているのでしょうか(細胞により違うとは存じますが)?2.タモキシフェン開始後、タンパクが欠損されるまで、大体どのくらいの期間を要するのでしょうか?3.タモキシフェンは1回投与のみで十分でしょうか?4.タモキシフェンが作用して遺伝子が除去された細胞は、以後分裂を繰り返しても目的遺伝子は欠損したままの状態であると考えても宜しいでしょうか?
以上です。なぜ目的遺伝子が除去されていないのかがはっきりせず、困っております。何卒ご教示のほど宜しくお願い申し上げます。
 
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No.680-9 - 2012/07/03 (火) 21:45:10 - ねこ
ご教示頂き有難うございました。
投与期間や投与後の日数についても更なる検討をしてみようと存じます。

(無題) 削除/引用
No.680-8 - 2012/07/03 (火) 13:46:56 - ~
欠損させる実験ではないので参考になるかはわからないのですが、
ROSAレポーター/CreERマウスの初代アストロサイトにタモキシフェンを与えた時は、
レポーターの蛍光タンパクが発現して顕微鏡で観察できるまでに24時間〜2日程度かかりました。
なので、1−4日の投与の場合最初の1日は正常な蛋白の発現があると考えられるのではないでしょうか?

蛇足になっていましたら申し訳ありません。

(無題) 削除/引用
No.680-7 - 2012/07/02 (月) 04:45:19 - ねこ
お返事いただき有難うございました。
投与後の期間についてももう少し検討をさせて頂こうと存じます。

(無題) 削除/引用
No.680-6 - 2012/07/01 (日) 22:02:57 - ~
私自身はvivoでしか経験がないですが、蛋白によってはかなり長く残るのではないでしょうか?

ただ、分裂が頻繁なら蛋白の代謝速度はあまり気にならないかもしれません。
マクロファージの分裂速度がどの程度か存じませんので、何とも言えませんが・・・

(無題) 削除/引用
No.680-5 - 2012/07/01 (日) 21:17:04 - ねこ

~様。
お返事有難うございました。それについても検討をさせて頂きます。
直接タモキシフェンを細胞に添加する場合、完全に欠損するまで最長で添加後どれくらい継続培養が必要であったか、もしご経験がございましたらご教示を頂ければありがたいです。

(無題) 削除/引用
No.680-4 - 2012/07/01 (日) 17:35:36 - ~
単純にCreで組換えが起こる前のたんぱく質がまだ存在するんでは?

もちろん、どんなたんぱくかにもよりますが・・

サザンをしてみてはいかがでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.680-3 - 2012/06/30 (土) 13:25:08 - ねこ
TK-1様
お返事頂き有難うございました。仰せのとおり、4-OHタモキシフェンを使用しています。マクロファージなので、細胞分裂もあります。ご指摘頂いた中で、標的遺伝子が欠損することで、かなり増殖が悪くなり、いくらかは死んでいるようなので、もしかしたら欠損が起こっていないものが生き残っているのかもしれませんね。大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用
No.680-2 - 2012/06/30 (土) 11:38:41 - TK-1
4 hydroxytamoxiphenを使ってますよね。

1.今回、タモキシフェン濃度は1uMで培養しましたが、どれくらいの濃度で皆様はご検討されているのでしょうか(細胞により違うとは存じますが)?
1nM~1uM

2.タモキシフェン開始後、タンパクが欠損されるまで、大体どのくらいの期間を要するのでしょうか?
蛋白による、細胞分裂があるかによる。

3.タモキシフェンは1回投与のみで十分でしょうか?
普通は

4.タモキシフェンが作用して遺伝子が除去された細胞は、以後分裂を繰り返しても目的遺伝子は欠損したままの状態であると考えても宜しいでしょうか?
反応は基本的には不可逆、でもその遺伝子が増殖やサバイバルに重要なら、切れ残りの細胞がドミナントになっていく。

タモキシフェン誘導性Creについてお教え下さい 削除/引用
No.680-1 - 2012/06/30 (土) 09:34:05 - ねこ
fl/fl CreERT2マウスから分離したマクロファージをタモキシフェンを混ぜた培地で培養し、タモキシフェン開始1−4日後にライセートを回収し、目的遺伝子が除去されたかどうかをウェスタンブロットで確認しています。しかし、タモキシフェン開始後1−4日の範囲では、目的遺伝子のタンパクは全く変化がありませんでした。以下の点についてお教え頂きたく投稿させて頂きました。1.今回、タモキシフェン濃度は1uMで培養しましたが、どれくらいの濃度で皆様はご検討されているのでしょうか(細胞により違うとは存じますが)?2.タモキシフェン開始後、タンパクが欠損されるまで、大体どのくらいの期間を要するのでしょうか?3.タモキシフェンは1回投与のみで十分でしょうか?4.タモキシフェンが作用して遺伝子が除去された細胞は、以後分裂を繰り返しても目的遺伝子は欠損したままの状態であると考えても宜しいでしょうか?
以上です。なぜ目的遺伝子が除去されていないのかがはっきりせず、困っております。何卒ご教示のほど宜しくお願い申し上げます。

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