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(無題) 削除/引用 No.6810-2 - 2018/04/03 (火) 14:02:55 - mon 5-10mM EDTAでの溶出が良いとおもいます。 PNGase Fは、EDTAで阻害されないようですし。 ttps://www.nebj.jp/products/detail/474

Hisタグタンパク質のPNGaseF処理について。 削除/引用 No.6810-1 - 2018/04/03 (火) 13:03:32 - 糖鎖屋さん いつも勉強させていただいています。 今、293T細胞で発現させたHisタグタンパク質に、N型糖鎖修飾が負荷されているかどうかを調べるため、PNGaseF処理することでSDS-PAGEした時にバンドの移動度に差が生じるか否かで検討しようと思っています。 そのために、cell lysateからNi-beadでプルダウンし、20 mM imidazoleを含むbufferで洗浄後、250 mM imidazole 1 mlで溶出しようと思っています。その後、その一部10 ul (1%)ほどをPNGase処理しようと思っています。 そこで質問なのですが、250 mM imidazoleが含まれていてもPNGaseFは問題なく働くのでしょうか？ 説明書には何も書かれておりませんでした。 Ni-beadでプルダウンしたものを剥がさずにPNGase F処理することも考えたのですが、PNGaseFは高価なので、できれば推奨されているように5-10 ulの反応スケールで酵素反応させたいです。 もし250 mM imidazoleでPNGaseFの酵素反応が阻害されてしまうようであれば、透析をしないといけませんね。。。。

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