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2通りのスプライスで3本のバンド トピック削除
No.6848-TOPIC - 2018/04/16 (月) 11:21:43 - masec
医学系の大学院生3年生です。

スプライス異常を有する患者検体や細胞株検体の
cDNAに対してPCRをかけることがよくあるのですが、
パターンが2通りしか想定されないにもかかわらず、
バンドが3本出るということがほぼ毎回見られています。

切り出し精製してSangerシーケンスで配列を見てみると、
1番サイズの小さいバンドと2番目に小さいバンドが
それぞれ想定通りの2通りのパターンの配列になっていて、
3番目のバンドはそれらの重なった配列になっています。

たとえば、ある遺伝子のExon3、4、5、6が読めるようにプライマーを設計し、
Exon4がスキップされるような異常が片アレルに起きているとすると、
小さいバンド(Exon3、5、6)と大きいバンド(Exon3、4、5、6)の他に、
さらに大きいサイズの所にバンドがあり、
配列を読んでみるとその2つが重なった配列になっています。
つまりForwardで読むとExon3までは一緒で、その後Exon4〜とExon5〜が
ほぼ1:1の波高で重なっており、
Reverseで読むとExon6、5までは一緒でその後Exon4〜とExon3〜が
やはりほぼ1:1の波高で重なっています。

切り出しの際にバンド間の距離はしっかり取っており、
混入することはないと思います。
また配列からはgDNAの混入も否定的です。

可能性として考えているのは、スプライス異常のある鎖とない鎖が
PCRの過程でミスアニールしていて、配列の合わない部分
(上記の例でいうとExon4)が片方の鎖で余剰としてループのようになっていて、
そのせいで泳動で流れづらく、サイズの大きいバンドとして
検出される、ということが起きているのではないかと疑っています。

しかし、そのような現象はよくあるのでしょうか?
教科書や論文、googleで何となく調べた範囲だとわかりませんでした。

皆さまのご経験や、あるいはそれに関して記載のある教科書など、
何かあればお教えいただけますと幸いです。
よろしくお願いいたします。
 
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ありがとうございます 解決済み 削除/引用
No.6848-4 - 2018/04/16 (月) 12:21:45 - masec
いろいろ検索してもわからなかったのですが、
「ヘテロ二重鎖」"heteroduplex"という単語を知らなかったもので、
それらで検索したらいろいろ出てきました。
おかげさまで裏が取れました。

お教えいただき、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.6848-3 - 2018/04/16 (月) 11:59:00 - AP
heteroduplexが出来ている。一本鎖に解離した鎖がプライマーとアニールして鋳型になるのではなく、一本鎖同士が再アニールする。この時異なるアリルの鎖同士がヘテロ二重鎖を形成するものもできて第三のバンドになる。サイクルが過剰なんじゃないか。

割と最近、似たようなトピがあったような

(無題) 削除/引用
No.6848-2 - 2018/04/16 (月) 11:52:12 - xyz
スプラインシング解析での経験ではありませんが
マイクロサテライトマーカーのPCRジェノタイピング(全長100bp〜300bp、アリル差3〜30bpとか)の電気泳動ではよくある現象です。

1kbのノックインアリルを両側からPCRしてヘテロだった場合でも同様に変な位置にバンドが出ることがありました。

2通りのスプライスで3本のバンド 削除/引用
No.6848-1 - 2018/04/16 (月) 11:21:43 - masec
医学系の大学院生3年生です。

スプライス異常を有する患者検体や細胞株検体の
cDNAに対してPCRをかけることがよくあるのですが、
パターンが2通りしか想定されないにもかかわらず、
バンドが3本出るということがほぼ毎回見られています。

切り出し精製してSangerシーケンスで配列を見てみると、
1番サイズの小さいバンドと2番目に小さいバンドが
それぞれ想定通りの2通りのパターンの配列になっていて、
3番目のバンドはそれらの重なった配列になっています。

たとえば、ある遺伝子のExon3、4、5、6が読めるようにプライマーを設計し、
Exon4がスキップされるような異常が片アレルに起きているとすると、
小さいバンド(Exon3、5、6)と大きいバンド(Exon3、4、5、6)の他に、
さらに大きいサイズの所にバンドがあり、
配列を読んでみるとその2つが重なった配列になっています。
つまりForwardで読むとExon3までは一緒で、その後Exon4〜とExon5〜が
ほぼ1:1の波高で重なっており、
Reverseで読むとExon6、5までは一緒でその後Exon4〜とExon3〜が
やはりほぼ1:1の波高で重なっています。

切り出しの際にバンド間の距離はしっかり取っており、
混入することはないと思います。
また配列からはgDNAの混入も否定的です。

可能性として考えているのは、スプライス異常のある鎖とない鎖が
PCRの過程でミスアニールしていて、配列の合わない部分
(上記の例でいうとExon4)が片方の鎖で余剰としてループのようになっていて、
そのせいで泳動で流れづらく、サイズの大きいバンドとして
検出される、ということが起きているのではないかと疑っています。

しかし、そのような現象はよくあるのでしょうか?
教科書や論文、googleで何となく調べた範囲だとわかりませんでした。

皆さまのご経験や、あるいはそれに関して記載のある教科書など、
何かあればお教えいただけますと幸いです。
よろしくお願いいたします。

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