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(無題) 削除/引用 No.6854-11 - 2018/04/24 (火) 13:56:06 - cDNA 読解力が低くてすみませんでした。私の勘違いも分かりましたが、自分のラボで同じことが起きたら、菌体を薄くすることをまず勧めます。とりあえず濃すぎるとしか思えません。 状況としては遺伝子型の判別をしたいが、コロニーPCRであるはずの遺伝子が適切に増幅されていない訳ですから、目的のサイズが出る方法を考えます。 これまでに改善に寄与した例としては、コロニーPCRだからと言って安いポリメラーゼを使わず、なんでもよく増えるものとして、PrimeSTAR GXLを使ったり、夾雑物に強い、MightyAMPあたりを試します。 タカラの回し者ではないですよ。

(無題) 削除/引用 No.6854-10 - 2018/04/24 (火) 12:58:27 - PP 書き方がわかりにくかったかもしれません。 コロニー１個全部を10ulに懸濁した時（全て懸濁できず、塊が残っていましたが）は、5uLの時に２本のみくっきり、本来出るべきサイズより少し上に出ました。<2ulでは5uLと同じ位置にものすごく薄ら２本ありましたが、スメアなどはありません。 液体培地で増やしたものをごく少量混ぜた場合やNaOH処理した場合も上記のサンプルとまったく同じ位置に２本のみで、それ以外はスメア含めて全くバンドは出ずきれいなものです。 普通に考えたら、サイズが違うのでノンスペなのですが、遺伝子A（482bp）がない時（DNA抽出したものをPCRして確認済み）は必ず800bpあたりのバンドは出ずに小さい方のバンドのみで、遺伝子Aがある時のみ２本でるんです。ノンスペの場合は遺伝子Aの有無にかかわらず２本でるのではないかと不思議に思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.6854-9 - 2018/04/23 (月) 18:28:58 - cDNA 最初の実験と、コロニーを培養した実験では菌体の持ち込み量が違うから違う結果になるのではないでしょうか。 最初の実験では5uL加えた時だけ新たなバンドが出るということは、より少ない量では目的のバンドのみが出たのだと思います。 コロニーを10uLに懸濁して、というコロニーはつまようじの先なのか、コロニー一個かにもよりますが、私が扱っている細菌はチップの先を少しコロニーに付けて100uLのmilliQに懸濁したものから1uLを20uLのPCRの反応系に入れてテンプレートにしています。 菌体量を増やすとスメアになったり何も出なかったりしますので、10uLから5uLも入れたのなら、よくある話だと思いました。 ノンスペというから気になるのであって、specificityの低いターゲットなのではないでしょうか。プライマーが菌体由来のヌクレアーゼで端が削れていって、たまたまアニールしやすい配列があるとか。菌体由来のゲノムDNAの断片だてプライマーになり得るでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.6854-8 - 2018/04/20 (金) 10:41:02 - xyz とりあえず増えたバンドをシークエンスしてみたらどうですか。 ノンスペかどうかはっきりとした証拠が得られるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6854-7 - 2018/04/20 (金) 10:34:51 - おお 長さが違うということは増えてきたDNAの配列が違うということ。これをノンスペと言わないなら何ていう？

(無題) 削除/引用 No.6854-6 - 2018/04/20 (金) 09:14:29 - PP とりあえず、一度コロニーを液体培地で増やし、�@抽出前の菌液からPCR、�ADNA抽出したものをPCRの２条件でバンドを比較してみました。 �@は、菌液をピペッティングした後、同じチップでPCRmixをピペッティングするという感じで、ごく少量菌が入るようにしました。 結果は、やはり�@のcolony direct PCR産物は�AのDNAからのPCR産物やポジコン、ネガコンのバンドより少し上にでます。ただ、遺伝子AとBの有無の結果は�Aとまったく同じになるので、ノンスペというのも納得がいかない感じです。 とりあえず、NaOHでの懸濁を試してみます。 > ・ただの菌体懸濁液ではPCRが掛からないが、10mM程度の希薄NaOHやTEに懸濁し、加熱処理した上清だとうまく掛かる。

(無題) 削除/引用 No.6854-5 - 2018/04/19 (木) 16:27:20 - おお ノンスペでしょうね（ただ泳動した結果たとえばバンドの具合とか見てないないのでなんとも言えない部分もあるけど）。

(無題) 削除/引用 No.6854-4 - 2018/04/19 (木) 13:48:23 - カートン箱 コメントを見ていただきありがとうございます。 菌の種類にもよりますが、経験上こんなこともありました。 ・ただの菌体懸濁液ではPCRが掛からないが、10mM程度の希薄NaOHやTEに懸濁し、加熱処理した上清だとうまく掛かる。 ・プレート培養開始後1日の菌体では上記処理液でPCRが掛かるが、2日目以降の古い菌体ではPCRが掛からない 細胞壁の硬い菌や、強固なバイオフィルムを作るような菌の場合、PCRテンプレート化に一工夫要るのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6854-3 - 2018/04/19 (木) 12:43:27 - PP コメントありがとうございます。 やはりノンスペと思われますか。 遺伝子AとB同時検出をやっていますが、抽出したDNAをTemplateとした場合は問題なくできています。細菌は選択寒天培地でコロニーにしてから採取しているので、目的の菌体以外はほとんど持ち込みなしだとは思いますが、菌のタンパクなどがミスアニールさせているのでしょうかね。 Template量や温度など色々いじってみます。 >[Re:2] カートン箱さんは書きました : > 初めまして。 > > 話を聞く限りではノンスぺの可能性が高いのではないかと思います。 > > クルードサンプルは細胞内容物（ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、各種イオン類etc.）が妨害物質として働くので正常ななPCRが掛かりにくいです。 > クルードサンプルに強いことを謳っているDNAポリメラーゼでも、菌によっては増幅性・正確性に差があるようです。 > > 仮にPCR産物の泳動度に影響するほどのクルードサンプル由来物を反応系に持ち込んでいたとすれば、そもそもPCRが掛かるかどうかという問題になると思います。 > > 他に考えられるのは、プライマーの特異性があまり高くなく、クルードの状態ではよけいミスアニールしやすいことでしょうか。 > 目的菌を単離したものでない場合は、他の菌や細胞のDNAにアニールして出た断片かもしれません。 > また、遺伝子AとBは別々にPCRをしているのか、それとも一つの形にプライマー4本を入れてPCRしているのでしょうか。後者ならプライマー１種類でもミスアニールすれば影響がでますね。 > > > ダイレクトPCR用にPCR系を最適化するのが先決な気がします。 > 不躾ながら、参考になる点があれば幸いです。

ノンスぺな気がします 削除/引用 No.6854-2 - 2018/04/18 (水) 18:20:36 - カートン箱 初めまして。 話を聞く限りではノンスぺの可能性が高いのではないかと思います。 クルードサンプルは細胞内容物（ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、各種イオン類etc.）が妨害物質として働くので正常ななPCRが掛かりにくいです。 クルードサンプルに強いことを謳っているDNAポリメラーゼでも、菌によっては増幅性・正確性に差があるようです。 仮にPCR産物の泳動度に影響するほどのクルードサンプル由来物を反応系に持ち込んでいたとすれば、そもそもPCRが掛かるかどうかという問題になると思います。 他に考えられるのは、プライマーの特異性があまり高くなく、クルードの状態ではよけいミスアニールしやすいことでしょうか。 目的菌を単離したものでない場合は、他の菌や細胞のDNAにアニールして出た断片かもしれません。 また、遺伝子AとBは別々にPCRをしているのか、それとも一つの形にプライマー4本を入れてPCRしているのでしょうか。後者ならプライマー１種類でもミスアニールすれば影響がでますね。 ダイレクトPCR用にPCR系を最適化するのが先決な気がします。 不躾ながら、参考になる点があれば幸いです。

colony direct PCRでバンドサイズがずれる？ 削除/引用 No.6854-1 - 2018/04/18 (水) 11:47:33 - PP いつも勉強させていただいています。 患者さんからサンプルを採取し、とあるグラム陽性細菌の遺伝子Aの有無をPCRで調べています。PCRは遺伝子Aと、その細菌特異的遺伝子B（コントロール）を同時に検出するようにしていて、それぞれサイズは482bpと173bpです。現在はDNAを抽出してからPCRをかけていて、特にノンスペもなくきれいに２本だけバンドが出るのですが、一度に処理するサンプル数が多くなってきたため、コロニーダイレクトPCRができないかと条件検討を始めました。 とりあえず、寒天培地のコロニーをMilliQ 10uLに懸濁し、それを0.5, 1, 2, 5uL PCR反応液に加えてtotal 15uLでPCRを行ったところ、5ul加えたサンプルでバンドが２本でましたが、どちらのバンドも比較対照として同時に抽出DNAを使ってPCRしたサンプルよりサイズが上にシフトしていました。<800bpと>300bpあたりにバンドがあるのですが、コロニーダイレクトPCRで、不純物のせいで泳動のバンドサイズがずれることはあるのでしょうか？それとも、これはノンスペですか。

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