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(無題) 削除/引用 No.687-7 - 2012/07/03 (火) 20:45:05 - Harmonia 基本アルカリ法だけど、 http://dna.brc.riken.jp/ja/MANUAL/manual_05_01.html のやり方。 この純度で制限酵素処理によるインサート確認と末端配列確認はできますよ。

(無題) 削除/引用 No.687-6 - 2012/07/03 (火) 09:16:20 - mon ~さんも指摘していますが、「精度」ではなく「純度」もしくは「精製度」ですね。結構、恥ずかしい間違いなので、早めに記憶を直しておきましょう。 スレッド違いですが、酵素の「熱失活（処理）heat inativation」を"heat shock"とされていた方もいましたし。 さて、BAC精製の経験はないのですが目的に合わせ精製法の特徴を考えて組み合わせてみたらいかがでしょうか。 PEG/NaCl沈殿：高分子の塩析法、タンパク・高分子DNA・高分子RNAが沈殿する。 フェノール抽出：除タンパク、除脂質 EtOH沈殿：高分子の沈殿法、タンパク・DNA・RNA(RNaseA処理しても）が沈殿する。除脂質。 塩の種類やEtOH等の濃度で、それぞれの沈殿率の調整がおおざっぱに可能。 大腸菌ゲノムの混入が問題なら、ATP-dependent DNase処理でlinear DNA, ss DNAを分解することが有効です（確か、Qiagen large construct kitに含まれているstep)。 イオン交換カラム法：タンパク・DNA・RNA(RNaseA処理が望ましい）を分離。 SiOカラム法：主に核酸が高塩濃度で結合し、低塩濃度溶液で溶出、BAC等の高分子DNAは加温したpH8.6ほどのTEでないと溶出効率が悪い(らしい）。Diatomaceous earth（珪藻土）で自作可能。

(無題) 削除/引用 No.687-4 - 2012/07/02 (月) 14:33:26 - み アルカリSDS抽出後、フェノクロ抽出、CIA抽出などで精度を上げて、最後にエタ沈してました。収量・精度ともに問題に感じたことないですが、質問者さんの目的にかなうかどうかは勿論わかりません。

(無題) 削除/引用 No.687-3 - 2012/07/02 (月) 11:02:11 - ~ 精度：計測器または測定法の正確さと精密さを含めた総合的なよさ 精度はサンプル自体や調整法についてではなく測定法についてのパラメーターかと思いますが。 アルカリSDS→PEG沈殿 と ミリポアのカラム（溶出は温めたバッファーで） でやっていました。

(無題) 削除/引用 No.687-2 - 2012/07/02 (月) 11:00:36 - AP 精製度重視で収量を気にしなければQuaigenでいきますが。目的によって必要とされる純度は違うので、闇雲に高純度を追い求めるのではなく、それを犠牲にしても収量をとったほうがいい用途もありますよね。 alkaline lysisで精製度が悪いとは、不純物は何で、何で判断しているんでしょうかね。PEG沈殿は試しましたか。

BACクローンの抽出 削除/引用 No.687-1 - 2012/07/02 (月) 07:10:51 - たまご いつもお世話になっております。 今回お聞きしたいのはBACクローンの大腸菌からの抽出方法です。 目的によって必要な精度も違うので抽出方法も異なると思いますが皆さんはどのような抽出方法を用いられていますか？ アルカリLysis法（フェノール抽出を含む） Kit (qiagen large construct kitや他社のもの） 私自身はアルカリLysisでもqiagenのキットも使いましたが、アルカリLysisだと精度が悪く、qiagenだと精度はいいのですが、収量がプロトコールに書かれているよりも低くなってしまいます。 皆さんが普段どのような方法を使ってらっしゃるのか参考にさせていただきたく、投稿しました。 よろしくお願いします。

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