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(無題) 削除/引用 No.6877-9 - 2018/04/30 (月) 16:58:14 - SYBR master >[Re:8] おおさんは書きました : > そうですね。それを書こうと思ったけどフェノクロ、エタ沈をその後にやってもだめと書いてあったので、、、 そうでした、それならUVの当てすぎが原因ですね。

(無題) 削除/引用 No.6877-8 - 2018/04/30 (月) 15:44:43 - おお >[Re:6] monさんは書きました : > 簡易カラムによるゲル精製時のトラブルの一つに、各遠心が不十分で、溶解試薬や洗浄試薬がカラムに残留し、溶出液に混入するということが有ります。 そうですね。それを書こうと思ったけどフェノクロ、エタ沈をその後にやってもだめと書いてあったので、、、

(無題) 削除/引用 No.6877-7 - 2018/04/30 (月) 15:44:33 - SYBR master 他の人も書いていますが、整理すると 1.ゲル泳動でEtBr+UVで可視化するときにUV(短波長)を30秒以上当てている。長波長側でもたしか1分以上で効率が悪くなる。関東化学が出しているviewaBlueの説明ページに具体例が出ていますので参考に。 お金持ちなら、SYBR-safeとか使用して、Blue-lightで可視化する。または目視でバンド視認できる、viewaBlue等の染色試薬に変更。買うのが面倒なら、視認用のウェルと回収用のウェルに分けて泳動して、回収用のウェルはUVが当たらないように、工夫する。 2. カラム精製を行うときに、遠心が足りずにわずかに残った洗浄試薬に含まれるエタノールがその後の反応を阻害することが、ままあります。 これらは、最後の遠心を1分x2回行う。遠心は冷却状態で無く、室温設定で行う。などで回避できます。

(無題) 削除/引用 No.6877-6 - 2018/04/30 (月) 09:49:08 - mon 簡易カラムによるゲル精製時のトラブルの一つに、各遠心が不十分で、溶解試薬や洗浄試薬がカラムに残留し、溶出液に混入するということが有ります。

(無題) 削除/引用 No.6877-5 - 2018/04/30 (月) 07:44:04 - おお UVあてすぎに一票。

(無題) 削除/引用 No.6877-4 - 2018/04/29 (日) 07:34:13 - AP それはきっとUV照射によるピリミジンダイマー形成が原因でしょう。 過去トピでもたびたび話題になっています。

(無題) 削除/引用 No.6877-3 - 2018/04/29 (日) 03:58:17 - 独り言 PCRのテンプレートはプラスミドですか？ もしそうであれば、PCR産物をそのままクローニングに用いたらプラスミドテンプレートが大腸菌に入って、コロニーはいっぱい生えるけど、当たりがほとんどでないと思います。 つまり今回ゲル精製が悪いのではなく、インサートの設計・ライゲーションの効率・トラフォメの効率などのどれかがうまくいっていない可能性はないですかね。 ただし、質問文にはPCR差物そのままの使用で当たりが取れるといっているから、違うのかな。当たりがそもそも取れたのなら、それで良いような気もしますが。

(無題) 削除/引用 No.6877-2 - 2018/04/28 (土) 23:11:30 - み UVあてすぎとか

クローニング時におけるゲル精製の悪影響の原因 削除/引用 No.6877-1 - 2018/04/28 (土) 23:00:38 - mono 最近、研究室に入った学生です。 新たなプラスミドの構築にあたって、インサートをPCRにて増幅しベクターへと導入しています。構築にあたって、インサートの調製にゲル精製の行程を挟むと、何故かクローニングの効率がほぼ0%になってしまいます(E. coliのコロニー自体が生えてこない)。PCR産物をそのまま利用すると、当たりのプラスミドが得られます。 ゲル精製による何らかの不純物の混入と考え、ゲル精製物にフェノクロ、エタ沈を行い、不純物の除去、バッファー交換を行い、PCR産物そのままと同じ条件でクローニングを行いました。ですが、E. coliのコロニーが得られず、PCR産物を利用したものはコロニーが得られました。 バッファーやゲルからの不純物が原因と考えていましたが、この方法でもクローニングがうまく行かないとなると原因が思いつきません。 これら以外の原因として考えられる要因はあるのでしょうか？ ゲル精製のキットとしては、日本ジェネティクス社のキットを使用しています。 よろしくお願いいたします。

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