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BL21の一晩培養でタンパク質が分解はあり得るか トピック削除
No.6883-TOPIC - 2018/05/01 (火) 21:48:51 - 困った院生
いつもBL21でIPTG 0.5 mM、30度で4時間誘導してタンパク作ってましたが、諸事情で一晩培養してしまいました。するとタンパク質がライセート中に見られませんでした。

一晩培養で、タンパク質が分解されてなくなるなんて事ありますか?
 
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No.6883-6 - 2018/05/02 (水) 10:35:40 - たぬき
「分解」かどうかは分かりませんが、IPTG後の時間経過で発現が減(ってみえ)るということは珍しくないです。そのタンパク質に関するプロトコルの時間をちゃんと守ったほうがよいです。
ものによってはより短い時間のほうが発現が良いということもありますが、条件を変更する場合は培養時間と温度をスモールスケールでテストされたほうがよいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.6883-5 - 2018/05/02 (水) 05:29:49 - おお
分解の可能性は否定できませんけど、菌体の状態(今回のスタートの時点や培養中など)などいろいろな要因を否定する材料がありません。

原因を考えるのは良いことですがあまり前に進みそうもないので、培養をやり直してはどうでしょうか?それでやはり発現が見られないようであれば培養時間の問題ではないだろうと言うことになりますし、ちゃんと発現すれば長期培養は良くないか、その長期培養のときたまたまなにか間違えたかなにか起こったと言うことで、長期培養を今後避けるということで実験するようにすればいいのではないかと。

ものによりますけど培養時間などタンパク質を作るときの条件を変えるとロット差も大きくなる可能性はあるでしょうから(必ずしも違いがあるとはいいませんけど)、条件を揃えるように心がけるほうがいいのではないかと思います。

(無題) 削除/引用
No.6883-4 - 2018/05/02 (水) 02:43:52 - み
一部をSDS抽出して目的蛋白が検出されなかったのならその条件では上手く発現してしなかったか分解されたかのいずれかと考えるかな。
しかし、前培養の条件や各段階での菌液の濁度などが記載されていないからあなたの今回の手技に問題がなかったか不明。
菌を増やすための種に問題がなかったのか?グリセロールストックをそのまま液体培地に入れるより一旦アガープレートに広げてシングルコロニーを拾い直した方が確実な場合もある。
検出方法も不明。精製濃縮すれば検出限界以上に達していたかもしれない。
蛋白の種類によるけど30度一晩でも発現するものは幾らでもある。
しかし、あなたの蛋白に関してはあなたが条件検討して最適化するしかない。
4時間培養と一晩培養を同時に行って比較してくれないと時間が問題だったとは判断できない。

(無題) 削除/引用
No.6883-3 - 2018/05/01 (火) 23:44:49 - 困った院生
Mさん、

大腸菌を回収し、溶菌前に、インプットとして菌体をSDSサンプルバッファーで可溶化しました。
その後、リゾチーム等で可溶性画分を回収し、残りを不溶性画分としました。

いずれにおいても目的のタンパク質が見られず、困っています...
一晩、30度、IPTG 0.5 mMでも問題ないのでしょうか..

(無題) 削除/引用
No.6883-2 - 2018/05/01 (火) 22:01:31 - M
ライセートにあることは何で確認しましたか?
「一晩培養で、タンパク質が分解されてなくなるなんて事」は経験したことがありませんが、
目的タンパク質が封入体あるいは何らかの不溶性の凝集物になっていて、
SDS-PAGEでは確認できなかったということがあるかもしれません。

BL21の一晩培養でタンパク質が分解はあり得るか 削除/引用
No.6883-1 - 2018/05/01 (火) 21:48:51 - 困った院生
いつもBL21でIPTG 0.5 mM、30度で4時間誘導してタンパク作ってましたが、諸事情で一晩培養してしまいました。するとタンパク質がライセート中に見られませんでした。

一晩培養で、タンパク質が分解されてなくなるなんて事ありますか?

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