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BrdU標識DNAプローブの調製とMembrane Hybridizaionについて トピック削除
No.6887-TOPIC - 2018/05/02 (水) 12:04:20 - TK
これまで、PCRによりDIGラベル標識プローブを調製してDNAのDot blotやSouthern hybridizationを行なっていたのですが、ふとBrdU標識でもできるのかが気になり調べてみたところ、Nucleic Acid Research, Vol19, No10, 2783 (1991)を見つけました。Non-RI法ではDIGを使われることが圧倒的に多いかと思いますが、何かDIG標識と比べてBrdU標識プローブを使う欠点があるのでしょうか（プローブの調製、検出などで）？抗DIG, 抗BrdU共に良い抗体が売られていますので、手順的には大きく変えずに利用できないかなと思っております。特にBrdUを使えると、だいぶ安く実験ができるようになるかなと思っております。
よろしくお願いいたします。
　
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ありがとうございます 削除/引用
No.6887-4 - 2018/05/02 (水) 15:02:37 - TK
AP様
お返事ありがとうございます。BrdU検出の際の変性操作についてすっかり失念しておりました。
先に書いたNucleic Acid Research, Vol19, No10, 2783 (1991)では、特に変性処理が書かれていないのですが（引用文献が一つ読めなくて詳細がわからないのですが、多分処理していないのではないかと思います）ハイブリシグナルは検出できているようです。むしろ、メンブレンの上だと抗体がアクセスしやすかったり、あるいはハイブリがきちんとできていない一本鎖部分を検出しているのかもしれませんね。プローブをデザインする時に、PCRプライマーの末端に短めの非標的配列などをあえて入れておけば、もしかすると使えるのかなとも思ったりします。ただ、そこまでしてBrdUにこだわっているわけではありませんが。
EdUの系はやはり高価かと思いますので、メンブレン ハイブリではDIGシステムでしっかりやるのが良さそうですね。
確かに、メンブレン ハイブリを使う実験が極端に減っていますね。。。

(無題) 削除/引用
No.6887-3 - 2018/05/02 (水) 13:45:13 - AP
二本鎖に対して良く反応する抗BrdU抗体は存在しないらしいです（文献古いですが）。だからやはり断片化、変性の過程が要求されます。これはプローブハイブリダイゼーションという原理と両立しませんね。

https://books.google.co.jp/books?id=qilOAi-uveQC&pg=PA168&lpg=PA168&dq=brdu+dna+probe&source=bl&ots=CqsVFqxLsZ&sig=EfeY17TRnE6YpQB_FF7OzyIbnSA&hl=ja&sa=X&ved=0ahUKEwir2O2rmubaAhWBupQKHVh7BhQQ6AEIWTAE#v=onepage&q=brdu%20dna%20probe&f=false

(無題) 削除/引用
No.6887-2 - 2018/05/02 (水) 13:32:52 - AP
実際のところはわからないですが、
BrdU標識DNAを抗体で検出するときDNAを塩酸やDNase Iで断片化しないとうまくいきませんね。ハイブリダイズしたプローブを断片化するとなると塩酸なんかだと解離する可能性があるし、短くなるとTmが下がるし、処理過程でプローブが外れる可能性大です。また、ブロットしたDNAにもダメージがあるわけでリハイブリがむずかしくなるでしょう。

今やBrdUも前時代の方法となっているみたいです。これからはclick chemistryの台頭でBrdUにかわってEdU (ethynyl deoxyuridine)ですよ。これだとDNAの断片化も必要ないし、DIGに替わるプローブラベルとして使えるんじゃないでしょうか。
ただ、ハイブリダイゼーションという手法自体がもうあまり需要がなくなってきているので、メーカーは製品開発する気がないかもしれません。

BrdU標識DNAプローブの調製とMembrane Hybridizaionについて 削除/引用
No.6887-1 - 2018/05/02 (水) 12:04:20 - TK
これまで、PCRによりDIGラベル標識プローブを調製してDNAのDot blotやSouthern hybridizationを行なっていたのですが、ふとBrdU標識でもできるのかが気になり調べてみたところ、Nucleic Acid Research, Vol19, No10, 2783 (1991)を見つけました。Non-RI法ではDIGを使われることが圧倒的に多いかと思いますが、何かDIG標識と比べてBrdU標識プローブを使う欠点があるのでしょうか（プローブの調製、検出などで）？抗DIG, 抗BrdU共に良い抗体が売られていますので、手順的には大きく変えずに利用できないかなと思っております。特にBrdUを使えると、だいぶ安く実験ができるようになるかなと思っております。
よろしくお願いいたします。
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