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(無題) 削除/引用 No.6891-7 - 2018/05/04 (金) 01:03:25 - 融解曲線 APさん 更に返信ありがとうございます。 >ここ、よんでくれた？ >PCR直後は鋳型をもとに合成された相補鎖とのパーフェクトマッチの二重鎖なので融解曲線はシングルピークだとしても、融解/再会合した時にヘテロな組み合わせができてる？ ごく普通（と思う）のリアルタイム-qPCRのプロトコールで、40cycle回しています。増幅曲線は20サイクル以降に立ち上がり始めて、35サイクル前位にはプラトーに達しています。これも自分の感覚で述べますが、ごく標準的な増幅曲線の図になっています。この場合には、36サイクル以降での95Cでdenature、60Cでアニーリング（と、2stepでやっているので増幅）のステップで、APさんのおっしゃる >相補鎖同士が再会合、そのときにヘテロ二重鎖ができ ている状態だと思います（標的に塩基多型があると仮定して）。 融解曲線は全PCRサイクルが回り終わった後に調べていますから、 >PCR直後は鋳型をもとに合成された相補鎖とのパーフェクトマッチの二重鎖なので融解曲線はシングルピーク とはならないかなあ、と思うのですが、私はなにか根本的な勘違いをしているでしょうか？ 昔の半定量的PCRの場合はプラトーに達する前にPCRサイクルを止めるのが大事だったかと思うのですが、最近のリアルタイムPCRではプラトーに達するまでサイクルを回すのが普通かと思っていましたが、これも勘違いでしょうか？確かに、指数関数的に増幅しているところで定量するから、プラトーに達する前に止めても問題は無いんですね。

(無題) 削除/引用 No.6891-6 - 2018/05/03 (木) 12:13:18 - AP 一般的にヘテロ二重鎖の移動は遅くなります。

(無題) 削除/引用 No.6891-5 - 2018/05/03 (木) 12:11:57 - AP ここ、よんでくれた？ >PCR直後は鋳型をもとに合成された相補鎖とのパーフェクトマッチの二重鎖なので融解曲線はシングルピークだとしても、融解/再会合した時にヘテロな組み合わせができてる？ サイクルが過剰だと解離した一本鎖を鋳型に相補鎖ができるのではなく、相補鎖同士が再会合、そのときにヘテロ二重鎖ができてPCR直後でも、ピークやバンドが複数できる場合があります。 しかし、PCR直後、そういうことが起こっていなくてパーフェクトマッチの二重鎖だけだとしても、多型があるなら、融解/再会合したときにヘテロ二重鎖が生じます。変異の有無を検出するヘテロ二重鎖法とかSarveyor酵素法とかそれを利用してますね。

(無題) 削除/引用 No.6891-4 - 2018/05/03 (木) 11:43:05 - 融解曲線 自己レスです。もっとよく考えたら、もしヘテロ二重鎖であれば、ヘテロ部分が高次構造をとるから泳動度が変わる（遅くなる？）ので電気泳動で二本バンドが見えることになりますね。 融解曲線について調べてみると、融解曲線の違いからヘテロを検出、というのをよく見るので、かなりセンシティブに違いが検出できるものだと思っていたのですが、ヘテロでも同一の融解曲線になることもあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6891-3 - 2018/05/03 (木) 11:10:16 - 融解曲線 APさん ありがとうございます。最初その可能性を考えたのですが、考えたら、その場合は融解曲線はダブルピークに、電気泳動は一本のバンドに（サイズそのものは同じだから）なるんじゃないかと思って混乱しているのですが、間違ってるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6891-2 - 2018/05/03 (木) 10:51:50 - AP 融解/アニルール後の産物の泳動でですか？ 標的に塩基多型があって、ヘテロ二重鎖ができているんじゃないでしょうか。  PCR直後は鋳型をもとに合成された相補鎖とのパーフェクトマッチの二重鎖なので融解曲線はシングルピークだとしても、融解/再会合した時にヘテロな組み合わせができてる？

融解曲線はシングルピークだが、電気泳動では二本 削除/引用 No.6891-1 - 2018/05/03 (木) 01:33:13 - 融解曲線 細胞から抽出したRNAよりcDNAを合成し、これをテンプレートとしてSYBR Greenを用いたリアルタイムPCRを行いました。融解曲線は綺麗にシングルピークになります。 この産物を電気泳動したところ、ほぼ一本に見えるが、実際にはかなり近接した二本のバンドが存在するように見えるゲル電気泳動の図が得られました。ゲルの分解能を上げて繰り返したところ、確かに二本のバンドでした。 融解曲線は綺麗にシングルピークになるが、産物は実際には二種類のミックスである、ということは有り得るのでしょうか？ テンプレートをその遺伝子の発現ベクターにして同様の作業をすると、電気泳動の図は間違いなくシングルバンドになります。

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