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バキュロウイルス発現系でタンパク質が分泌されません。 トピック削除
No.6899-TOPIC - 2018/05/05 (土) 11:04:42 - M2
M2と申します。ひと月ほど前にバキュロウイルス発現系につき質問させていただいたものです。

漸くといいますか、かなり時間がかかってしまったのですが、バクミドが採れたようです。
これをHigh5 cellという昆虫細胞にトランスフェクトしました。

導入後、48時間で細胞をPE-anti-baculovirus gp64 antibody (Biolegend)で染めると2-3割が陽性となり、細胞死も起きているようでした。この培養上清（P1ウイルス液）を次の細胞に感染増幅させつつ、以下のようにタンパク質ができているか、またどこにタンパク質があるのかにつき検討してみました。

まずP1ウイルス液に100％TCAを10％加え、氷上一時間後、10分遠心し、ペレットを冷アセトンで洗ったものを濃縮上清としました。（濃縮せず1xのものも調製しました。）

また、細胞はピペッティングで剥がし、500gで遠心後、PBSで洗いました。
この時気付いたのですが、バクミド導入していない細胞ペレットに比べ、バクミド導入した細胞ペレットが茶色でした。（上の図です）

この細胞ペレットを1％TritonX100を含む細胞溶解バッファーで可溶化し、10分氷上に置いたのち、遠心して上清の可溶性画分と、ペレットのデタージェント不溶性画分を得ました。

すると、バクミド導入したデタージェント不溶性画分が茶色というか黒色でした。（下の図です）
この不溶性画分はSDSサンプルバッファーとソニケーションで可溶化させました。


これら、
デタージェント不溶性画分、デタージェント可溶性画分、1x上清、25x上清でそれぞれヒスタグに対する抗体でウエスタンを行なったところ、デタージェント不溶性画分で予想されるサイズにバンドを認めました。

ここで質問させていただきたいのですが、

このデタージェント不溶性画分に来るということは、昆虫細胞でも封入体に入ってしまっているということでしょうか？となるとグアニジン塩酸、尿素等で可溶化し、リフォールドを行う必要が出てきますでしょうか？

タンパク質のデザインとしては、膜貫通ドメインを欠損させたもので、C末にhis6-Strep-Tag IIタグを持たせています。同じデザインを293Tに哺乳動物用プラスミドを使って発現させると、その時にもなぜだか分泌されず、細胞内に留まっていました。

どうにか培養上清に分泌させて、その後精製したいです。
どうかお力いただけませんでしょうか？よろしくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.6899-19 - 2018/05/11 (金) 11:56:07 - おお
>おおさんへ＞Ｎ末には分泌シグナルがそのまま残っているようです。

Ｎ末のシグナルはERの表面にアクセスするためのものではないですか？これが残っていても、そのあとにたとえば正電荷のアミノ酸が並ぶと、シグナルペプチドのC-末をサイトゾル側に向けてしまったりってないでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.6899-18 - 2018/05/11 (金) 04:19:02 - M2
おおさん、 monさん夜分に恐れ入ります。ありがとうございます。


monさん
そのような経験がおありだったんですね。
私のタンパク質は正直メジャーなタンパク質でして、随分機能解析はやられています。
ただ、組替えタンパク質を作ったという報告は、巨大な製薬企業が行なった昆虫細胞の系でのみ報告されており、当然私のデザインも細胞外へ分泌されるものと考えておりました。

製薬企業のデザインは、
N末シグナル配列ー細胞外ドメインーヒス8タグ

私のデザインはC末のタグがヒス6タグともう一つ別のタグが付いてるだけです。

実は、海外のサーモフィッシャーのテクニカルデパートメントに、分泌されないことを相談しましたところ、先ほどメールが返ってきまして、哺乳動物細胞のシグナル配列は昆虫ではうまくワークしない場合が多々ある。そのため我々は”special HBM insect secretion system”を推奨する、と返信がありました。ミツバチのもつシグナル配列を利用した分泌タンパク質作成キットのようです。（TOPO cloning）


> 全長タンパクを過剰発現させてもデタージェント不溶性画分にくるようなら、かなりfoldingしづらいタンパクなのかなと思います。

なるほど...可能性大ですね。。
実は書きませんでしたが、P1ウイルスを回収し、P2ウイルスを作成すると、ウイルス力価はかなり減少します。おかしいですよね...きっとトキシックなのだと思います。


> 可溶性発現にはコファクター的な別タンパクが必要？
> 最初は脂質等の膜アンカーが付加さえるのかと思いましたが、「デタージェント不溶性画分」との事だから、そうでもなさそうだし。

実は今そのタンパク質と相互作用するタンパク質を網羅的に解析するプロジェクト（質量分析）も始めています。
コファクターが釣れれば面白いですね。

ただ質量分析後にタンパク質間相互作用を証明するため、やはり組替えタンパク質をそれまでに作っておきたいです...


おおさんやmonさんは、昆虫細胞が黒くなる現象に遭遇したことはございますでしょうか？
これはメラニンなのでしょうか？昆虫細胞のチオウレア処理により、タンパク質産生や分泌はあがるでしょうか....

(無題) 削除/引用
No.6899-17 - 2018/05/11 (金) 04:01:56 - mon
おおさんへ＞Ｎ末には分泌シグナルがそのまま残っているようです。
私も過去、DBのアノテーションを信じて（勘違いして）I型膜タンパクと早とちりしていたものが有りました。M2さんと同様のコンストラクでは分泌せず、論文検索・SigPot等(だったかな）でI型膜タンパクだと思っていた領域が切断されないようだと思い、2回膜貫通タンパクだと考え直したところ想像通りの結果になった経験があります。

さて、思いつきですが、
全長タンパクを過剰発現させてもデタージェント不溶性画分にくるようなら、かなりfoldingしづらいタンパクなのかなと思います。
可溶性発現にはコファクター的な別タンパクが必要？
最初は脂質等の膜アンカーが付加さえるのかと思いましたが、「デタージェント不溶性画分」との事だから、そうでもなさそうだし。

(無題) 削除/引用
No.6899-16 - 2018/05/10 (木) 15:43:25 - おお
>[Re:15] M2さんは書きました :
> >[Re:12] おおさんは書きました :
> > ざっと読んだ感想ですが、もしかしたらデリーションやらなんやらで、ER上で合成されるときのトポロジーが変になっているかもとおもいましたが、、、
>
> すみません、書き方に語弊が生じますね。
> 膜貫通ドメイン”以降”を削っています。
> そのため一型膜タンパク質の、細胞外ドメインに、C末にタグをもたせたものを昆虫にて発現させようとしています。

要するに膜貫通ドメインがないわけでしょ？ERで合成中、それらの配列が細胞質側と認識されたら分泌されないですよね。

(無題) 削除/引用
No.6899-15 - 2018/05/10 (木) 11:42:46 - M2
>[Re:12] おおさんは書きました :
> ざっと読んだ感想ですが、もしかしたらデリーションやらなんやらで、ER上で合成されるときのトポロジーが変になっているかもとおもいましたが、、、

すみません、書き方に語弊が生じますね。
膜貫通ドメイン”以降”を削っています。
そのため一型膜タンパク質の、細胞外ドメインに、C末にタグをもたせたものを昆虫にて発現させようとしています。

(無題) 削除/引用
No.6899-14 - 2018/05/10 (木) 11:40:33 - M2
monさん、ありがとうございます！

> > Strep-Tag IIタグには成功体験ないですね。。
> 大腸菌でpriplasmiから精製を試みたけど、回収率が低かった経験しかない。
> KdがuMオーダーですので、濃度が高くないとイマイチ。

そうなんですかー...
8アミノ酸程度でしたので、プライマー合成が簡単ですし、それに乗っかってしまいました。
Kdが低いというのは盲点でした。ストレプトアビジンがfemtoオーダーなので、それに比べたらずっと低いんですね。

> > SBPやCBP(N5A)が親和性も高いし、最近のお気に入りです。
> KdがnM~pMオーダーですので回収率が高いです。
> CBP(N5A):RWKKNFIAVSAANRFKKIS
> DOI:10.1016/j.jmb.2015.06.018
> SBP:GHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQG
> DOI:10.1107/S0907444913002576

ありがとうございます！
まずはどういったときに使われるタグなのか、盲点はないのか調べてみます。

(無題) 削除/引用
No.6899-13 - 2018/05/10 (木) 11:15:31 - mon
> Strep-Tag IIタグには成功体験ないですね。。
大腸菌でpriplasmiから精製を試みたけど、回収率が低かった経験しかない。
KdがuMオーダーですので、濃度が高くないとイマイチ。
> SBPやCBP(N5A)が親和性も高いし、最近のお気に入りです。
KdがnM~pMオーダーですので回収率が高いです。
CBP(N5A):RWKKNFIAVSAANRFKKIS
DOI:10.1016/j.jmb.2015.06.018
SBP:GHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQG
DOI:10.1107/S0907444913002576

(無題) 削除/引用
No.6899-12 - 2018/05/06 (日) 10:10:42 - おお
ざっと読んだ感想ですが、もしかしたらデリーションやらなんやらで、ER上で合成されるときのトポロジーが変になっているかもとおもいましたが、、、

(無題) 削除/引用
No.6899-11 - 2018/05/06 (日) 09:40:37 - M2
monさん、ありがとうございます。

> Strep-Tag IIタグには成功体験ないですね。。

そうなのですね...確かここのフォーラムでオススメされていたので使ってみました。笑。
成功体験というのは、試されたことすらないのか、それとも試したけどうまく精製できなかった、のどちらでしょうか？

> SBPやCBP(N5A)が親和性も高いし、最近のお気に入りです。

メモしました。ありがとうございます。
特にCBPタグというのは聞いたことがありませんでした。調べてみます。

> もっともタグが原因か否かは不明ですね。

そうなんですよね...Fcタグでも分泌されませんので...

(無題) 削除/引用
No.6899-10 - 2018/05/06 (日) 09:38:36 - M2
AP様、

大変示唆に富むコメントをありがとうございます。
バキュロウイルスに感染した幼虫は黒く溶けるとは写真で見たことがありましたが、これを培養細胞で私は見ていた、ということなんですかね...すごい。。

ポリフェノールオキシダーゼ阻害剤が有効かもしれませんね。ありがとうございます。
もう少し調べてから検討したいと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.6899-9 - 2018/05/06 (日) 08:17:12 - mon
Strep-Tag IIタグには成功体験ないですね。。
SBPやCBP(N5A)が親和性も高いし、最近のお気に入りです。
もっともタグが原因か否かは不明ですね。

(無題) 削除/引用
No.6899-8 - 2018/05/05 (土) 16:16:49 - AP
上清に出てこないのはまた別の話で、
翻訳と共役してER内に取り込まれる→内膜輸送系で能動輸送される
という過程のどこかが止まっているんですね。やっぱり細胞がある程度元気じゃなきゃできなさそう。

(無題) 削除/引用
No.6899-7 - 2018/05/05 (土) 15:57:15 - AP
タンパク質が沈殿に入ってしまうのは巨大なpolyphenol複合体と共沈しているのかもね。タンニン（柿渋）みたいなポリフェノールはタンパク質を吸着・沈殿して除去するのにも使われることだし。

https://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%9F%BF%E6%B8%8B
「タンニンが水溶性タンパク質と結合して沈殿を生じる性質は清酒の清澄剤として利用されており、今日ではこの用途で最も多く用いられている」

(無題) 削除/引用
No.6899-5 - 2018/05/05 (土) 15:47:01 - AP
昆虫細胞はphenol oxidase (PO)の活性によりpolyphenol (メラニン類）が生じます。これは昆虫の免疫作用のひとつ（生じる過酸化物で攻撃するなど）ですが、polyphenolは細胞毒性があるようです。POの活性により感染したり死にかけている昆虫個体や細胞、あるいはホモジネートなんか真っ黒になります。ホモジネートや血液（ヘモリンフ）が黒化しないようにするのにPO阻害剤のphenyl thiourea （PTU)を添加する方法がありますが、培養細胞に使用する試みもあるみたい。

https://books.google.co.jp/books?id=1cO5vlb5dUUC&pg=PA275&lpg=PA275&dq=sf9+cell+polyphenol&source=bl&ots=QN_7heAc0P&sig=uMNKzn3oDdOsew_bMPnQesAaljY&hl=ja&sa=X&ved=0ahUKEwjK7JjZ9-3aAhVMlJQKHYc7AXMQ6AEIKzAA#v=onepage&q=sf9%20cell%20polyphenol&f=false

ひょっとするとPO活性やpolyphenolの蓄積によって細胞が死にかけてるとか発現系が妨害されるとかでうまくいかないんじゃないでしょうか。逆に発現タンパク質が毒性で細胞が死にがちで黒くなるのかもしれません。なにせウイルス感染している状態ですからね。

(無題) 削除/引用
No.6899-4 - 2018/05/05 (土) 13:51:35 - M2
monさん、早速書き込みいただき誠にありがとうございます。

タンパク質は1型の一回膜貫通タンパク質です。

N末のシグナル配列（20アミノ酸ほど）- 細胞外ドメイン (ゴルジ内腔ドメイン) (約950アミノ酸ほど) - 膜貫通ドメイン （20アミノ酸ほど）- 細胞内ドメイン (50アミノ酸ほど)ですが、N末のシグナル配列と細胞外ドメインのみを分泌させようとしています。

実はこのタンパク質はアストラゼネカ社が昆虫細胞（Sf9）で分泌精製している論文があります。
その論文ではC末のHis8タグだけでした。僕はC末にGSSSSリンカー、His6タグ、Strep-Tag IIタグを持たせています。

これらタグが悪さをしているのでしょうか？

ただ、293Tで発現させたコンストラクトは、N末のシグナル配列と細胞外ドメインにIgG Fcをつけたものでした。これでも分泌されませんでした。

昆虫細胞で界面活性剤不溶性の画分というのは封入体ということになるのでしょうか？

質問に質問を重ねてしまい恐縮ですが、ご存知でしたらご教示お願いしますm(_ _)m

(無題) 削除/引用
No.6899-3 - 2018/05/05 (土) 13:41:23 - mon
＞タンパク質のデザインとしては、膜貫通ドメインを欠損させたもので、
通常I型膜タンパクなら、シグナルペプチド〜膜貫通ドメインまでの細胞外ドメインを発現させると、分泌されます。
II型膜タンパクor 複数膜貫通タンパクと言うことはありませんか？
つまりN末（付近）の疎水性ドメインが膜貫通ドメインで、膜にアンカーされているとか。

(無題) 削除/引用
No.6899-2 - 2018/05/05 (土) 11:09:23 - M2
Fastpicがメンテナンス中のため、ファイルなうに画像を投稿しました。

https://d.kuku.lu/4fe717cdc4

バキュロウイルス発現系でタンパク質が分泌されません。 削除/引用
No.6899-1 - 2018/05/05 (土) 11:04:42 - M2
M2と申します。ひと月ほど前にバキュロウイルス発現系につき質問させていただいたものです。

漸くといいますか、かなり時間がかかってしまったのですが、バクミドが採れたようです。
これをHigh5 cellという昆虫細胞にトランスフェクトしました。

導入後、48時間で細胞をPE-anti-baculovirus gp64 antibody (Biolegend)で染めると2-3割が陽性となり、細胞死も起きているようでした。この培養上清（P1ウイルス液）を次の細胞に感染増幅させつつ、以下のようにタンパク質ができているか、またどこにタンパク質があるのかにつき検討してみました。

まずP1ウイルス液に100％TCAを10％加え、氷上一時間後、10分遠心し、ペレットを冷アセトンで洗ったものを濃縮上清としました。（濃縮せず1xのものも調製しました。）

また、細胞はピペッティングで剥がし、500gで遠心後、PBSで洗いました。
この時気付いたのですが、バクミド導入していない細胞ペレットに比べ、バクミド導入した細胞ペレットが茶色でした。（上の図です）

この細胞ペレットを1％TritonX100を含む細胞溶解バッファーで可溶化し、10分氷上に置いたのち、遠心して上清の可溶性画分と、ペレットのデタージェント不溶性画分を得ました。

すると、バクミド導入したデタージェント不溶性画分が茶色というか黒色でした。（下の図です）
この不溶性画分はSDSサンプルバッファーとソニケーションで可溶化させました。


これら、
デタージェント不溶性画分、デタージェント可溶性画分、1x上清、25x上清でそれぞれヒスタグに対する抗体でウエスタンを行なったところ、デタージェント不溶性画分で予想されるサイズにバンドを認めました。

ここで質問させていただきたいのですが、

このデタージェント不溶性画分に来るということは、昆虫細胞でも封入体に入ってしまっているということでしょうか？となるとグアニジン塩酸、尿素等で可溶化し、リフォールドを行う必要が出てきますでしょうか？

タンパク質のデザインとしては、膜貫通ドメインを欠損させたもので、C末にhis6-Strep-Tag IIタグを持たせています。同じデザインを293Tに哺乳動物用プラスミドを使って発現させると、その時にもなぜだか分泌されず、細胞内に留まっていました。

どうにか培養上清に分泌させて、その後精製したいです。
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