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組織中の抗体の局在を見たい トピック削除
No.6904-TOPIC - 2018/05/08 (火) 10:54:58 - パートさん
目を通していただきありがとうございます。
よろしくお願いいたします。

マウス肺の、とある抗体の局在を見たいのですが、なにかいい手はないでしょうか?
その抗体(仮に抗A抗体とさせていただきます)が、病態モデルのマウスのBAL中に、多量に出てくることは確認済みです。
さらに、肺の気道上皮の辺りに、抗A抗体の局在が見られたらいいなあと思っています。
組織切片上で見る場合、単純な免疫組織染色ではないとは思うのですが、物質AそのものにFITCが標識されたものが売っていましたので、普通に蛍光免染をしてみました。
しかし、自家蛍光が強く、自家蛍光を消す試薬も使用しましたが、コントロールとの差は見られませんでした。
自家蛍光が完全に消えないので、差がよく分からないといったところです。
凍結切片を使用しています。
蛍光が無理なら、物質AにHRPやビオチンを付けて、免染したら染まるでしょうか?
そもそも組織切片上の抗体に、標識した抗原を付けて染めることって出来るんでしょうか?
 
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28件 ( 1 〜 20 )  前 |  1/ 1. 2. /2


(無題) 削除/引用
No.6904-31 - 2018/05/11 (金) 08:17:56 - SK
組織切片にした場合、肺胞内や気管支腔に分泌された抗体が切片に保持されなければ、組織切片で見れるのは浸潤した形質細胞の内部(主にER)に存在する、分泌前の抗体になります。 抗体の機能を保つため、未固定の凍結切片でAを反応させていると思いますが、固定透過なしで細胞内抗体と反応できるか、ちょっとわかりません。実際の凍結切片処理のプロトコールは、どんな感じでしょう?

あるいは、標識したAを経鼻あるいは経気道でマウスに投与し、体内で反応させてから肺組織を回収するのはどうでしょう? 免疫複合体を形成する場合は、肺胞マクロファージに捕捉されて、本来の 局在を反映しない可能性も否定はできないですが、組織切片にしてから反応させるよりは、生理的な条件での抗原抗体反応が見れるような気がします。

内在性のAの局在をDABの免染で見てあるようですが、細気管支上皮で染まるのでしょうか? 内在性のAは分泌タンパクあるいは細胞表面タンパクで、細胞外の抗体と免疫複合体を形成するのでしょうか? あるいは、Aは細胞内タンパクで、死細胞などから放出されて免疫複合体を形成するのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.6904-30 - 2018/05/11 (金) 08:09:59 - SK
しっかり追えてないので、見当違いかもしれませんが、何点か。

ウシAとの交差性の確認は、BAL中の抗A抗体定量と同じメソッドにした方が良いかも。マウスAを固相化したプレートでBAL中の抗A抗体を捕捉して、抗マウスIgG二次抗体を用いたELISAで検出しているのであれば、同様にウシAを固相化したプレートを用いて交差性を判断できるのでは?

マウス肺の場合、細気管支上皮細胞の自家蛍光はかなり強いと思いますので、蛍光染色で見るのは大変かもしれません。 Emission波長で500-600くらいのレンジでは、検出波長を長くしても細気管支上皮の自家蛍光はあまり変わりませんが、far redに近づけると多少マシになるかもしれません。

AをHRPで標識できれば、DABでの非蛍光染色、あるいはTyramideを用いた蛍光シグナル増幅が使えるので、自家蛍光対策としての選択肢は増えると思います。

(無題) 削除/引用
No.6904-29 - 2018/05/11 (金) 04:25:18 - パートさん
1qw2lo90p様、ご回答ありがとうございます。

抗A抗体はIgGになります。

なるほど、そのような可能性もあるのですね。
とても難しくて、今の私にはちょっと手の出しようがないですが、参考にさせていただきます。
ありがとうございました。

誤植の訂正追加 削除/引用
No.6904-28 - 2018/05/11 (金) 00:31:30 - 1qw2lo90p
4行目 抗IgA抗体(誤)→抗A抗体(正)

誤植があったので訂正します。 削除/引用
No.6904-27 - 2018/05/11 (金) 00:29:52 - 1qw2lo90p
3行目 抗IgA抗体(誤)→抗A抗体(正)

(無題) 削除/引用
No.6904-26 - 2018/05/11 (金) 00:27:49 - 1qw2lo90p;@:^[
たぶん局所にplasma cellがいて抗体産生してるとおもうので、抗A抗体の存在する組織からImmunoglobulin heavy chain (BALに出てくるということは抗A抗体はIgAですか?もしそうならα鎖になりますが-----)遺伝子クローニングするとかして、抗IgA抗体の可変領域のアミノ酸配列を明らかにして、それ抗原にして抗IgA抗体の可変領域にたいする特異抗体はつくれないでしょうか?最近あまり話題になりませんが、抗体に対する抗体に対してまた抗体ができて---みたいな免疫ネットワークとかideotype抗体とか人工抗体とかそういう少し前の仕事がに役に立つようなきがします。免疫関係は素人なので、専門的なことはわかりません。より具体的な事はその方面の専門の人に相談してみて下さい。

(無題) 削除/引用
No.6904-25 - 2018/05/10 (木) 18:52:05 - パートさん
今日、蛍光ELISEで、交差性を確かめたところ、確認出来ませんでした。

方法としては、BAL中の抗A抗体を測定した時とほぼ同程度の濃度に調整して行いました。

ブラックのハイバインディング96穴プレートに、炭酸バッファーで調整した抗A抗体を10μg/mlで固相化、これはスタンダードに使用しているマウス抗A抗体です。
同時にマウスBALも10μg/ml相当になるように炭酸バッファーで調整し、固相化。
1%BSAでブロッキング、FITC標識ウシAを10μg/mlで添加。
洗浄後、1%BSAを加えて、プレートリーダーで蛍光測定しました。

手順、容量などで、間違えはないでしょうか?
ちなみにFITC標識ウシA10μg/mlをウェルに入れて、そのまま蛍光測定した数値は約60でした。

(無題) 削除/引用
No.6904-21 - 2018/05/10 (木) 05:20:25 - おお
切片上でFITCラベルされた抗原と反応させ、そこから抗体を回収してFITC蛍光活性があるかどうかで実際に抗体抗原反応が起こっているか確認できるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用
No.6904-20 - 2018/05/10 (木) 03:55:08 - おお
>病態モデルのマウスのBAL中に、多量に出てくることは確認済みです。

その抗原特異的な抗体がこの方法で検出できるということは、組織にある抗体はフリーか、この方法論では検出用に加えた抗原が反応するということですよね。とすると組織上でも再現できる方法論はあるかもとおもいますが。

monさんが的確なアドバイスをしていると思いますが、すべてフォローする余裕が無いですが。。。

もし仮に抗原がついているとしたならば、酸やアルカリで外すというのはIgGのアフィニティーカラムなどではやりますので応用できるかもしれません。

自家蛍光が邪魔しているのと、加えたラベルされた抗原が反応しているのは別問題だから、まずは自家蛍光の対処をしてからとなりますが、、、自家蛍光が見られない波長はないですか?Anti-FITC抗体も売られていますのでそれで違う蛍光で見れるかも。

FITC標識された抗原はその抗体と反応することは確認していますか?(BAL中の抗体をプレートに貼り付けてそのラベルした抗原で検出するとか)。もしこれで確認できるとするならば、組織に抗原フリー(もしくはFITC標識された抗原が反応する余地)はあるのではないでしょうか?もしこの系で一度抗原をリリースさせてからでないと反応しないなら、組織でもそうかも知れません。

>蛍光が無理なら、物質AにHRPやビオチンを付けて、免染したら染まるでしょうか?
それは選択肢ではあると思います。

(無題) 削除/引用
No.6904-19 - 2018/05/09 (水) 21:55:54 - mon
> 結合した状態だと、組織切片上では検出は難しいということですかね。
物質Aの大きさが抗体と比較してどれくらいのものかに寄ります。
例えば、低分子化合物や10merペプチドくらいだと、ずっぽり抗体のCDR内部にはまって外部からの抗体での検出は難しくなります。ただし全てではありません。実際GABAなんかのサンドイッチELISAシステムが販売されているくらいですし。
あくまでも抗体・抗原の結合状態(立体構造)に依存しますね。いわゆる鍵と鍵穴というアナロジーはあくまでも特別な抗体・抗原の結合状態ですし。。

(無題) 削除/引用
No.6904-18 - 2018/05/09 (水) 18:22:42 - パートさん
雑多な複合体・・・
検出したいのは、マウス肺で発現した抗マウスA抗体で、おそらくフリーの形ではなくマウスAと結合した状態のもので・・・

途中からELISEの話になりましたが、結合した状態だと、組織切片上では検出は難しいということですかね。

(無題) 削除/引用
No.6904-17 - 2018/05/09 (水) 17:44:11 - mon
抗A mAb>「A-ポリクローナル抗体」>HRP標識抗ヒトIgGmAbもありか。。
通常は
抗A mAb>「A-ポリクローナル抗体複合体」>HRP標識抗ヒトIgGポリクローナル抗体 だけど。
数十年語り尽くされたお話ですよ。

(無題) 削除/引用
No.6904-16 - 2018/05/09 (水) 17:38:48 - mon
モノクローナル抗体2種のサンドイッチELISAでなく、ポリクローナル抗体同士のサンドイッチELISAですから、雑多な抗体-A-抗体複合体が形成されることをイメージしてください。

(無題) 削除/引用
No.6904-15 - 2018/05/09 (水) 16:57:03 - パートさん
>なお、(抗体でマスクされている物質Aの一部分があるから)「全ての」複合体を検出しているのではなく大部分(かな?)ということは承知してください。

まだ抗体に付くだけの余力がある複合体ということですよね?


この複合体に、抗ヒトIgGが付くのですか?

(無題) 削除/引用
No.6904-14 - 2018/05/09 (水) 16:42:34 - mon
なお、(抗体でマスクされている物質Aの一部分があるから)「全ての」複合体を検出しているのではなく大部分(かな?)ということは承知してください。

(無題) 削除/引用
No.6904-13 - 2018/05/09 (水) 16:38:46 - mon
抗IgGを固相化(可能であれば共有結合)>複合体を付けて>抗A抗体でサンドイッチ
も考えられます。ただしIgGの総量が問題となります。
マウス抗A抗体を固相化(可能であれば共有結合)>複合体を付けて>抗ヒトIgG
も有りです。ただしFreeAの総量が問題となります。

(無題) 削除/引用
No.6904-12 - 2018/05/09 (水) 16:23:12 - パートさん
ELISA法については、結構経験があります。
競合法、サンドイッチ法、直接吸着法などがあり、どれも行ったことがあります。
実際、今回の血中、BAL中の抗A抗体の定量は、物質Aを固相化、サンプル(抗A抗体)、酵素標識抗IgG、発色基質で測定しているので、直接吸着というのでしょうか?
市販されているELISAキットはほとんどがサンドイッチ法だと思いますが・・・。
物質A-抗A抗体複合体を測定する場合を考えましたが、この複合体がmon様がおっしゃるように安定なのでしたら、何を固相化しても付かないのではないのですか?
抗体部分には付かないけど、抗原側は固相化した抗体に付くとか?
抗IgGを固相化して、複合体を付けて、抗A抗体でサンドイッチ?
う〜ん、難しいです。
頭悪くてすいません。

(無題) 削除/引用
No.6904-11 - 2018/05/09 (水) 15:12:41 - mon
> やはり、抗原抗体複合体には、抗原はそのまま付かないのですね・・・。
抗体IgGには抗原に結合する腕が2本有るので必ずしも抗原が1分子の抗体タンパクに結合しないと言えませんが、抗原抗体複合体自体は「比較的」安定なので結合している腕の抗原は外しづらいです。

> 抗原抗体複合体の抗体を作る・・・ 難しそうですね。
一仕事ですが、素晴らしい成果が得られるかも。検査薬に使えるなら一括千金??

> ELISAで定量するにしても、組織切片上で見るにしても、その”抗原抗体複合体の抗体”が必要になってくるということですよね。
「サンドウィッチELISA」を勉強してください。必ずしも必要ではありません。

(無題) 削除/引用
No.6904-10 - 2018/05/09 (水) 10:45:20 - パートさん
そうです。
正にそれがやりたいことです。

やはり、抗原抗体複合体には、抗原はそのまま付かないのですね・・・。


抗原抗体複合体の抗体を作る・・・
難しそうですね。

ELISAで定量するにしても、組織切片上で見るにしても、その”抗原抗体複合体の抗体”が必要になってくるということですよね。

的外れかもしれませんが 削除/引用
No.6904-9 - 2018/05/09 (水) 10:15:58 - 門外漢
組織中のAに結合している抗A抗体をに対して標識Aを結合させて見たい、という話なんですよね。
それなら抗(A-抗A抗体複合体)抗体を作った方が良さそうな…?
組織ホモジネートでELISAなりして、抗体および抗原抗体複合体を定量しないと信頼性が低いと思いますが。

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