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(無題) 削除/引用 No.6921-6 - 2018/05/18 (金) 04:40:50 - おお あとたまにブロッキング液のスキムミルクが腐ってきてブロットがダメになるというのを見たことがありますが、、、

(無題) 削除/引用 No.6921-5 - 2018/05/18 (金) 04:32:08 - おお >二次抗体であるHRP-anti-rabbit 1 ulとって、 mycやFlagのよく使われる抗体はマウスモノクロだと思いますが、Rabbitの抗体を使ってるのですか？

(無題) 削除/引用 No.6921-4 - 2018/05/17 (木) 16:35:44 - AP ライセートを一晩おいたんでしょう？ その間に分解したというのがもっともあり得そう。 保存溶媒、保存環境は如何に

(無題) 削除/引用 No.6921-3 - 2018/05/17 (木) 16:14:13 - み 前日に検出できたサンプルを再度流して検出できていないのだから、2回目の泳動以降に問題あるんじゃないかな。 GAPDHも出てないようだし。 しかし1回目のmyc検出が正しかったのかも不明。 mycが問題なくworkしていたと仮定しても、FLAGがworkするかは調べてみないと分らない。 まあ色々と問題点はありますが、もう一度過剰発現からやり直して、ポジコンとネガコンを設けて調べるべきでしょう。 non-transfectサンプルやコントロール抗体によるIP、myc抗体、flag抗体によるIPを用意して2枚のメンブレンを作って、myc抗体によるblotとflag抗体によるblotを行えば白黒つくでしょう。

(無題) 削除/引用 No.6921-2 - 2018/05/17 (木) 15:55:03 - 774 １次抗体か2次抗体がダメになってるような感じですね。 他の可能性を挙げるなら、タンパク抽出に異常はありませんか？ ゲルをCBB、PVDFをポンソーで染めると原因の切り分けができると思います。

ウエスタンがうまくいかない（GAPDHのbandすら出ない） 削除/引用 No.6921-1 - 2018/05/17 (木) 15:29:51 - ウエスタン玄人 ウエスタンをかれこれ1000回はやってる技術員です。 myc-FLAGタグ付きタンパク質発現ベクターを293T細胞に過剰発現し、まずライセートで目的のタンパクが発現していることをmyc抗体を用いて前日にウエスタンでチェックしてます。そしてその日に仕込んだflagタグ抗体を使ったIPサンプルを翌日に調製し、前日のライセートをポジコンとして今回のIPサンプルを解析しました。 ところがmyc抗体でIBすると、前日ライセート（ポジコン）すらバンドが認められず、何かがおかしいと思い、もう一度over nightでmyc抗体でIBしました。しかしそれでもbandが認められず、今度はflag抗体でIBしましたが、それでもだめでした。なんのバンドも出ずです。 二次抗体であるHRP-anti-rabbit 1 ulとって、それをECLに乱暴ですが加えると茶褐色になりました。 以上のことから少なくともHRPはok. そしてECLもok. さらに、それをx-ray filmに焼き付けるときちんとフィルムが真っ黒になったので、X^ray filmもok, developerもokそうです。 PVDF膜にはmolecular markerがきちんと転写されており、問題ないはずです。 ただぽんそーでは染めていません。何が原因でしょうか。実は別の膜をGAPDH抗体でIBしても何もでませんでした。何が原因でしょうか？

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