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(無題) 削除/引用 No.6923-24 - 2018/05/20 (日) 14:46:31 - み 20%くらいの導入効率でゴルジに局在する蛋白で、仮に抽出効率が悪く150kDaの蛋白を効率良く検出できない学生レベルの人が実験しているなら、分解だの消失だのという主張はまずは同意できない。 GFPベクターはサイズ小さいから簡単に導入、検出できるが、下手な人だとinsert3kb以上になると全ての効率が落ちる場合が多々ある。 ダブルでなくシングルトランスフェクトして(導入試薬の量も多めのサンプルも用意して)、6センチシャーレや場合によっては10センチシャーレでRIPAで回収し、タグ抗体でIP濃縮して6%ゲルで検出しろと指導する。 IPが下手な人なら新たな問題が出てくるでしょうが。

(無題) 削除/引用 No.6923-23 - 2018/05/20 (日) 08:36:42 - おお >ただ、そのタンパク質を発現させるとコトランスフェクとしたEGFPの導入効率は10％ほどでした。原因は不明です。ただタンパク質が大きいのが原因だろうかと考えています。150kDほどです。 これを読むとTransfectionがあやしいなぁと言う印象はあります。 プラスミドのPurityや濃度見積もりの誤差が大きいとこういうことが起こることがあります。あとはプロモーターの干渉とかもあるかもしれませんがGFPが落ちているのなら、目的の遺伝子のプロモーターがドミナントになっている可能性もあるのでちょっと違うかもしれません。 プラスミドのPurityに関してはいろいろ対処方法があるでしょうけど、騙されたと思ってやってみてくださいという簡単な方法は、飽和ウレアを１：１の容量で加えてエタ沈です。 他にやれそうなことはCell sortingでGFPポジだけを取ってくるとか、ちょっとLong shotですが、Tet誘導性クローンを作るとか、Tetでなくてもステイブルなクローンが得られればよりよいかもしれません。 １５０kDaはちょっと意識するとそんなにWBが難しい類ではないと思います。WetならO/Nのトランスファーでたいてい大丈夫ですし、そうでなくてもゲル濃度やメタノール濃度でコントロールできる範囲だと思ってます。そもそも分離ゲルにはいって移動するぐらいだから、分離ゲル中を横に移動して外に出ることができるわけだし。

(無題) 削除/引用 No.6923-22 - 2018/05/20 (日) 05:20:44 - ウェスタン なんか小言ばっかりみたいなコメントになってしまって申し訳ない。読み流して下さっても良いのですが。 >IFでは見えて、ウエスタンでは見えません。それは本当なんです... 別にウソだと疑っている訳ではなくて、そのIFで見えているのは本当に目的タンパクですか？というのが私の疑問なのです。おそらく み さんの疑問もそうだと思う。私はIF懐疑主義者的なところがあるのかもしれませんが。 やはりそのタンパク自体に対する抗体というのは存在しないのでしょうか？私は、強制発現系でのタンパクの局在は必ずしも正しい位置にはならないことがあると習ったし、自分でも経験したし、知り合いがトピ主様と同じようにゴルジに出ると言っていたがきちんとマーカーを使って調べたら実際は違っていたということも経験があります。 KO細胞があるという話ですが、話の流れで言うと（おそらく抗体がない。あるならtagでのWBで困っていない）確認はRT-PCRでしょうが、私はタンパクレベルで確認できていなければ本当にKOされているかどうかわからないと判断します。同様の主義の人は多いと思います。なので、もちろん >そのタンパク質は翻訳後修飾酵素です。その酵素を欠く細胞に導入（10％程度ですが...）して、ウエスタンすると、その翻訳後修飾は回復します。ブラックホワイトですので、10％でも見やすいのだと思います。 というのは理屈の上ではわかる話ですが、なんか腑に落ちないのです。 PEIでのcotransfectionに関して、私はPEIを使ったことがないのでわからないです。申し訳ない。他の方の意見をお聞きしたいところです。 PEIでのcotrasnfectionで、シングルでは多く入ったのにcotransfectionにしたら全て殆ど入らなくなった、という話は聞いたことがあったかもしれませんが、記憶違いかも。 み さんが検出限界以下なんじゃないかと仰っていましたが、WBでの手技上の問題だった、という簡単なオチがついたりはしないですかね？ 150 kDaだと、semi-dryでは検出しづらい（これ位の大きさならsemi-dryで見ている人もたくさん入ると思うが、メーカーの説明書でも100kDa以上はwet推奨なんて書かれてるし）ので。150kDa程度のタンパクの検出は過去に経験がありますか？

(無題) 削除/引用 No.6923-21 - 2018/05/19 (土) 16:50:03 - おお ん、ゴルジに局在するタンパク質なのか、、、 ゴルジだけに存在するなら細胞あたりのその蛋白の量は少ないかな？ いっその事膜蛋白だけ回収したほうが良さそうな気がしてきた。

(無題) 削除/引用 No.6923-20 - 2018/05/19 (土) 10:03:20 - こりまり ウェスタン様、み様、何度もありがとうございます。感謝しております。 > トピ主様の考えでは、WB用にサンプルを調整しようとすると、プロテアーゼによって目的タンパクが一瞬で破壊されるということですよね？あまり無さそうというか、逆に、もしその現象が本物ならそのプロテーゼの機構そのものが新規発見に繋がるように思います。 プロテアーゼで壊されるのかはわかりませんが、IFでは見えて、ウエスタンでは見えません。 それは本当なんです... > 一応確認したいのですが、「トランスフェクトされたものにはGFPが光るようなデザイン」というのは、発現ベクターは目的遺伝子とtagとGFPの三つ全てがfusionした形でタンパクを発現するようにデザインされているのでしょうか？であればGFPに対する抗体でWBしてバンドが得られると思うのですが、これは既に試されましたか？ いえ、IRESや2Aの系ではなく、2つのプラスミドを同時にトランスフェクトしています。 従いまして、GFPの融合ではありません。 > 目的遺伝子+tagを発現するベクターとGFP発現ベクターをco-transfectionして、GFPを発現したものを目的遺伝子+tagがトランスフェクトされたとしている、わけでは無いですよね？ その通りです。 私の全ての実験はCOS-7です。IFは綺麗に行きます。ただウエスタンはまったくです。 タンパク質が大きいので、発現しにくいのかトランスフェクトされにくいのかと考えています。 そのタンパク質は翻訳後修飾酵素です。その酵素を欠く細胞に導入（10％程度ですが...）して、ウエスタンすると、その翻訳後修飾は回復します。ブラックホワイトですので、10％でも見やすいのだと思います。 今はレンチウイルスベースでIRESのプラスミドを構築しましたので、GFP陽性を細胞をソートし、その細胞での翻訳後修飾をウエスタンで、またその酵素自身をきっとウエスタンでは検出されないとは思いますが、IFで確認しようと思います。 ウエスタン様のコトランスフェクションに関する考察に関してですが、PEIを使った場合も同じでしょうか？ 実は別の実験で、あるヒトの膜タンパク質を、それが発現していないCOS7に導入しました。その後フローサイトで検出すると2峰性の山が出まして、おそらくトランスフェクトされたものと、そうでないものだろうと考えました。 そこで、次にDsRedだけが発現するただのベクターと、そのヒト膜タンパク質のプラスミドをコトランスフェクとすると、DsRedを発現する細胞でのみ、そのヒト膜タンパク質が陽性となりましたので、以上のことから、コトランスフェクトした場合、（少なくとも私の実験操作条件では）2つのプラスミドは一つの細胞に入る確率は高いのだろうと思われます。 >GFP陽性の細胞で綺麗にタグでの染色が強くゴルジ体に認められます。 ＞はちょっとおかしいなと思います。 来週にはIRES-GFPでソートした細胞が増えてくると思いますので、きちんと調べてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6923-19 - 2018/05/19 (土) 09:28:35 - ウェスタン >そのタンパク質のKO細胞に過剰発現すると、リードアウトとなる表現型が見られますことから、確かにそのタンパク質は過剰発現された細胞で作製されており、機能的であると考えられます。 COSを使ってですら発現誘導がほとんど出来ていない（10%程度）と考えているのに、発現させるのがもっと難しいであろう細胞での過剰発現はうまくいっている、あるいは、10%程度の誘導効率で過剰発現させたディッシュで見られる表現型（の回復）が発現誘導されたタンパクによるものと考えておられるのですか？可能性ゼロとは言わないけれど、あまり無いことだと思います。 先に書いたコメントについて。トピ主様の新しいコメントから察するに、「トランスフェクトされたものにはGFPが光るようなデザイン」はコトランスフェクションで調べたように思われますが、コトランスフェクションでは、一つのベクターが入ったからもう一つのベクターも入っているとは言えないですよ。特に誘導効率が悪かったら尚更です。仮に両ベクターが共に10%程度の誘導効率であれば、両方入っているのはかなり稀でしょう（理屈上は100個に一個か）。なので、 >GFP陽性の細胞で綺麗にタグでの染色が強くゴルジ体に認められます。 はちょっとおかしいなと思います。

(無題) 削除/引用 No.6923-18 - 2018/05/19 (土) 08:18:17 - おーみ うちではTCA固定したサンプルからの抽出は尿素入りバッファーでやっています。 http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo%208.html

(無題) 削除/引用 No.6923-17 - 2018/05/19 (土) 07:35:50 - こりまり 実はCOS7でも293Tでも行なっています。 IFはCOS7をメインに使っています。 ただいずれの細胞でもウエスタンはワークしません。 MG132やクロロキン処理でもタンパク質は見えません。 ただし、そのタンパク質のKO細胞に過剰発現すると、リードアウトとなる表現型が見られますことから、確かにそのタンパク質は過剰発現された細胞で作製されており、機能的であると考えられます。また、そのタンパク質の機能欠失体（ミスセンス変異）ではそのリードアウトの表現型は見られません。 コントロールとしてEGFPだけの導入効率はCOS7や293Tでは8割ほどです。（PEIでのトランスフェクション）ただ、そのタンパク質を発現させるとコトランスフェクとしたEGFPの導入効率は10％ほどでした。原因は不明です。ただタンパク質が大きいのが原因だろうかと考えています。150kDほどです。 > proteasomeによる分解や限定分解でtag検出ができなくなっている可能性も否定できないがその可能性は低いと思う。 > Txでは抽出されない蛋白の可能性もある。 Txでは抽出されないですか...それは考えていませんでした。 それではやはり一瞬にして細胞を変性処理するようなもので次回タンパク質を調製してみます。 > 他の人も指摘しているが免染のシグナルがまともな分子量の蛋白を検出している保証はない。 > 要するにコンストラクトが完成している保証はあるのか？ 上の述べたような機能アッセイのリードアウトから、そのタンパク質ができていると考えています。 シークエンスのダブルチェックも行なっています。

(無題) 削除/引用 No.6923-16 - 2018/05/19 (土) 07:30:09 - ウェスタン 更に念のために書いておくと、間にIRESを挟んだ発現ベクターを使われていてGFPの発現が見られる場合でも、み　さんが懸念するように、コンストラクトが正しいかどうか（目的遺伝子+tagの部分、それが強く発現するかどうか）はまだ確定していないですね。

(無題) 削除/引用 No.6923-15 - 2018/05/19 (土) 07:29:01 - こりまり おお様、ありがとうございます。 TCAを使ったタンパク質抽出方法が載っていました。 https://www.gelifesciences.co.jp/technologies/ettan_dige/dojo03_03.html まさにこれですね。 TCAアセトン沈殿でのタンパク質抽出はルーチンにはやっているので、確かに不溶化はしますが、ソニケーションとSDS化でなんとかサンプルは調製できそうです。 ちなみに尿素を使う方法ですが、尿素でしたらそのままウェルにアプライできますよね。 ただどれくらいの％のものをどれくらいの量6-ウェルに加えますか？あるいは濃縮はどうされますでしょうか？ >[Re:11] おおさんは書きました : > もちろんWellに直接TCAを加え、回収してWBという方法はありますし、好んでこの方法を使う人もいるようです。 > ただし ６Wellから全部流そうとすると数百マイクログラム程度で、通常のミニゲルだとオーバーロードになってかえってバンドが見えないかも。 > > TCAを使ったあとの蛋白回収は不溶化してリカバリーにばらつきが出たりすることもありますのでそのへんはこの方法に手慣れた人のアドバイスがあったほうがベターかも知れません。わたしなら尿素を使いますが。。。

(無題) 削除/引用 No.6923-14 - 2018/05/19 (土) 05:56:15 - ウェスタン 私も概ね　み　さんと同じような印象です。 トピ主様の考えでは、WB用にサンプルを調整しようとすると、プロテアーゼによって目的タンパクが一瞬で破壊されるということですよね？あまり無さそうというか、逆に、もしその現象が本物ならそのプロテーゼの機構そのものが新規発見に繋がるように思います。 み　さんが仰るように、293細胞あたりに発現させてみて、それでもWBで検出できないかどうか調べてみると良いと思います。 一応確認したいのですが、「トランスフェクトされたものにはGFPが光るようなデザイン」というのは、発現ベクターは目的遺伝子とtagとGFPの三つ全てがfusionした形でタンパクを発現するようにデザインされているのでしょうか？であればGFPに対する抗体でWBしてバンドが得られると思うのですが、これは既に試されましたか？ 目的遺伝子+tagを発現するベクターとGFP発現ベクターをco-transfectionして、GFPを発現したものを目的遺伝子+tagがトランスフェクトされたとしている、わけでは無いですよね？一応、念の為にお聞きしておきます（以前この点で勘違いされてる人と話したことがあるので）。

(無題) 削除/引用 No.6923-13 - 2018/05/18 (金) 17:50:25 - おお IFでなん％位入っていると見積もられるのだろうか、、、 ２０％位入ってればWBでも通常のやりかたで見れそうな気がするけど、、、ただいろいろなファクターがあるので見れるか見れないかの判断はこれだけではできませんけど。 IP-WBはできないというけど、変性条件下で抽出して非変性的条件に戻してIPするという手も取れるけどね。そうすると一度変性した蛋白は非変性的条件に戻して再度活性を持つものは殆ど無いだろうからもし本当にプロテアーゼの影響を気にしているなら一つの方法論だとおもう。やり方は１％のSDSが入った溶液で溶かしてすぐ加熱して変性後に１％Triton （場合によってはさらに０．１％ほどのDeoxycholate）のバッファーで１０倍希釈。まあ変性してIPできる環境に戻すのだから違う方法でもいいけど。 ただ検出できないからといって簡単にプロテアーゼのせいだと言い切っていいのか、、、

(無題) 削除/引用 No.6923-12 - 2018/05/18 (金) 12:23:21 - み 最初にtransfect効率が悪いと記載されている。 ならばhek293やCOSなど効率のよい細胞で発現させている蛋白が本当に検出できないのか確かめてほしい。 HEKで高発現させてSDS buffer中でBoilしてみたらどうか。 要するに検出限界以下の実験系でやっているだけじゃないのかな？ proteasomeによる分解や限定分解でtag検出ができなくなっている可能性も否定できないがその可能性は低いと思う。 Txでは抽出されない蛋白の可能性もある。 他の人も指摘しているが免染のシグナルがまともな分子量の蛋白を検出している保証はない。 要するにコンストラクトが完成している保証はあるのか？

(無題) 削除/引用 No.6923-11 - 2018/05/18 (金) 12:13:32 - おお もちろんWellに直接TCAを加え、回収してWBという方法はありますし、好んでこの方法を使う人もいるようです。 ただし ６Wellから全部流そうとすると数百マイクログラム程度で、通常のミニゲルだとオーバーロードになってかえってバンドが見えないかも。 TCAを使ったあとの蛋白回収は不溶化してリカバリーにばらつきが出たりすることもありますのでそのへんはこの方法に手慣れた人のアドバイスがあったほうがベターかも知れません。わたしなら尿素を使いますが。。。

(無題) 削除/引用 No.6923-10 - 2018/05/18 (金) 12:10:26 - こりまり 独り言様ありがとうございます。 PBSで洗いもせずですか。FBSのコンタミが気になります。 液体窒素でプレートごと凍結させてその後PBSを加え、掻き取り、遠心してから溶解という流れでは、細胞が死んでいますので、壊れた細胞膜から内容物が外に出たりしないのでしょうか？気になります。 ウェスタン様ありがとうございます。 IFはタグに対する抗体で免疫染色しています。トランスフェクトされたものにはGFPが光るようなデザインで、一過性に発現させ、GFP陽性と、陰性の細胞でタグに対する抗体の染まり方を見ると、当然といいますか、GFP陽性の細胞で綺麗にタグでの染色が強くゴルジ体に認められます。ただ、本当に不思議なんですが、ウエスタンするとそのタグの抗体では全く見えません。

(無題) 削除/引用 No.6923-9 - 2018/05/18 (金) 11:59:15 - ウェスタン >IFでPFA固定すると綺麗に染まってくれます IFで見てるものが単なるnon-specificなものだったりしませんかね？このIFのvalidationはどうやっておられるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6923-8 - 2018/05/18 (金) 10:53:05 - 独り言 聞いた話では、1分でもシグナル伝達系に影響が出てしまう実験では、 培地をアスピレーターで完全に取り除いたら、PBSで洗いもせずに、液体窒素で瞬間的に凍結するらしいです。 その後、cold PBSでかきとる。細胞が死んでいるから、反応はほとんど起こらないはず。 遠心してから上清を取り除き、lysis bufferを加えるので溶液量も少なくできる。

(無題) 削除/引用 No.6923-7 - 2018/05/18 (金) 10:45:06 - こりまり みさん。 ＞あるいはPBS中でスクレーパーで回収、遠心後のペレットを材料にすればさらにvolumeは減らせる。 ご提示いただいた方法は試したことはありません。 物理的に細胞を剥がすのですよね。ダメージが多そうな印象です。 私のタンパク質はどうも厄介で、ひょっとしたことで発現が消失するんです（原因不明です。） なので細胞培地を除去後、瞬時に細胞、というよりタンパク質を変性させたいです。 消失メカニズムはわかりませんが、きっと瞬時にプロテアソームなどで分解されるのかもしれません。 なので消失メカニズムが働くより前に、目的のタンパク質を変性剤中に落とし込みたいです。 なので、免疫沈降もきっとうまくいかない気がします。 唯一そのタンパク質が検出される条件はIFです。 ウエスタンの抗体が悪いわけではないです。

(無題) 削除/引用 No.6923-6 - 2018/05/18 (金) 10:40:14 - PP 分解の早い蛋白をTCA固定してから抽出したことがありますが、 １）dishをPBS wash ２）10%TCAを加えてスクレーパーで回収 ３）遠心 3,000rpm 10min ４）上清をすて、沈殿にサンプルバファー(BPB入り)を加える ５）すぐに1M trisで中和 ６）超音波処理、加熱 でうまくいきました。

(無題) 削除/引用 No.6923-4 - 2018/05/18 (金) 10:11:54 - こりまり 774さん。 トランスフェクション効率が悪いので、6-ウェルの50％からほぼ全てをSDSPAGEしたいんです。 ただタンパク質分解がそのタンパク質だけ早いのか、1％TritonX100入りのデタージェントバッファーで普通に調製すると何も見えないんですよ。ただIFでPFA固定すると綺麗に染まってくれますね。 なので50ulほどに濃縮したいです。うち20ulをゲルにアプライですね。 10％TCAで細胞を瞬時に破壊というのはあかんですかね...？

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