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(無題) 削除/引用 No.6934-3 - 2018/05/23 (水) 11:50:55 - おお まあ５０mMで溶出されても驚きませんけど、Niカラム自体そんな精製度が上がるカラムではないから１００mMで溶出できるようになったからと言ってモノ以外検出できないという状態からは程遠い可能性はあります。非変性条件下でも取れているなら、尿素を入れて精製してあとで沈殿してしまう面倒な選択肢より、非変性でやったほうがいいでしょう。 よりきれいにするにはその後他のカラムにかけるとかするほうがいいと私はおもいます。 NiカラムだけというならGradientをかけて溶出し、目的のものの量を測定して、その両ギリギリのきゃぱのNiカラムで吸着して溶出するとどれくらいと保証しませんがよりきれいになるでしょう。 Niの代わりにコバルトなどをつかったカラムもあるのでイオン交換などかける環境が整わないなら、NiとCo二種類で精製するといいかもしれませんが、使用経験がありませんのでどの程度うまくいくかはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.6934-2 - 2018/05/23 (水) 11:23:05 - タンパク初心者 私もタンパク質精製ではみなさまに大変お世話になっていますので、何かお力になれればいいのですが。 50 mMで溶出されるんですね・・・それは本当に目的のタンパク質ですか？ タンパク質に対する抗体でウエスタンはされましたか？ 色々条件検討するのも手ですが、それと同時並行でコンストラクションを見直されるといいかもしれません。 つまり、His6タグと目的のタンパク質の間にグリシン-セリンからなるリンカーを長く持たせておくとtagの埋没の可能性は低減されるかもしれませんね。

変性条件下でのhisタグ精製 削除/引用 No.6934-1 - 2018/05/23 (水) 11:10:11 - あか いつもお世話になっております。 N末端にhisタグを付加した組換えタンパク質の精製を試みています。 非変性条件下で、hisタグのカラムへの結合能が弱く、 50 mMイミダゾールで溶出されてしまうため、夾雑バンドが多く困っています。 タグが埋没していることが原因だと考え、6M尿素で変性させてからHisタグ精製を試みましたが、非変性条件と変わらず、50mMイミダゾールで溶出されます。 また、6M尿素入りのバッファーで透析し、変性させたところ、タンパクが析出しました。 �@変性剤をグアニジンに変えれば、タグがより露出することでカラムに結合しやすくなり、溶出されるイミダゾール濃度が上がることはあるのでしょうか �A尿素での変性させたときにタンパク質が析出してしまった場合どのように対処すればよいでしょうか よろしくお願いいたします。

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